Μελέτη της Κρυστάλλωσης Εστερασών του Γλυκουρονικού Οξέος από το Μύκητα Podospora anserina

Abstract

Τα τοιχώματα των φυτικών κυττάρων αποτελούν την πιο πλούσια πηγή άνθρακα στη γη και η αξιοποίησή τους σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές έχει προσελκύσει τα τελευταία χρόνια ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον. Ειδικό-τερα, οι ερευνητικές προσπάθειες των τελευταίων ετών έχουν στραφεί στη μείωση του ενζυμικού φορτίου και κατά συνέπεια του κόστους που απαιτεί-ται για την αποικοδόμηση του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος και την οι-κονομικά συμφέρουσα παραγωγή βιοαιθανόλης σε βιομηχανικό επίπεδο. Πρόσφατα ανακαλύφθηκε μια εστεράση που καταλύει το δεσμό εστέρα με-ταξύ του D–γλυκουρονικού ή 4–O–μεθυλ–D–γλυκουρονικού οξέος της γλυ-κουρονοξυλάνης και των αλκοολών της λιγνίνης, οδηγώντας στη δημιουργία μιας νέας οικογένειας υδατανθρακικών εστερασών στη βάση δεδομένων CAZy (Carbohydrate–Active enZYmes Database), αυτής των εστερασών του γλυκουρονικού οξέος (CE15). Στόχος της παρούσας διπλωματικές εργασίας ήταν η μελέτη πρωτεϊνών αυτής της νέας οικογένειας.

Αρχικά γίνεται μια ανασκόπηση της σύστασης του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος και των ενζύμων που συμβάλουν στην αποικοδόμησή του. Στη συνέχεια γίνεται μια εισαγωγή στις υδατανθρακικές εστεράσες και ανάλυση των ιδιοτήτων και των χαρακτηριστικών των ενζύμων που ανήκουν στην οικογένεια CE15 της CAZy. Αναλύεται επίσης η μέθοδος της κρυσταλλογρα-φίας ακτίνων Χ ως εργαλείο για τη δομική μελέτη των μακρομορίων.

Σκοπός της εργασίας ήταν η ετερόλογη έκφραση και ο καθαρισμός των πρωτεϊνών PaCE15A και PaCE15B, αμφότερες από τις οποίες ανήκουν στην οικογένεια CE15 της CAZy και προέρχονται από το μύκητα Podospora anse-rina. Η κλωνοποίηση και η έκφραση πραγματοποιήθηκαν μέσω της μεθυλό-τροφης ζύμης Pichia pastoris. Στη συνέχεια επιχειρήθηκε η ανάπτυξη κατάλ-ληλων κρυστάλλων (φύση, μέγεθος, σχήμα, περίθλαση ακτίνων Χ) ώστε να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό της τρισδιάστατης δομής των πρωτεϊνών. Βρέθηκε ότι κρύσταλλοι της πρωτεΐνης PaCE15B αναπτύσσονται παρουσία οξικού νατρίου και θειικού αμμωνίου, σε τιμή pH ίση με 4,6. Οι κρύσταλλοι εκτέθηκαν σε συγχροτρονική ακτινοβολία ακτίνων Χ στο Αμ-βούργο (SRS at EMBL-Hamburg Unit/DESY) και ακολούθησε προκαταρκτικός χαρακτηρισμός αυτών. Ο προσδιορισμός της τρισδιάστατης δομής βρίσκεται αυτή τη στιγμή σε εξέλιξη.

Plant cell walls are the most abundant source of organic carbon on the planet and their exploitation in biotechnological applications has attracted significant research interest. Recent research efforts have focused on the re-duction of protein load required for the breakdown of lignocellulose to fer-mentable sugars, as the enzymic cost is currently the main obstacle of bioe-thanol production at industrial scale. Recently an esterase hydrolyzing the ester bond between 4–O–methyl–D–glucuronic acid residues of glucuronoxylans and aromatic alcohols of lignin was reported, leading to the emergence of a new family (CE15) of carbohydrate esterase on the continously updated CAZy database (Carbohydrate–Active enZYmes Database), the family of glucuronoyl esterases. The aim of the present work was to explore this new family.

In the first part, the plant cell wall composition as well as the enzymes in-volved in its degradation are described. An introduction to the carbohydrate esterases is being made and the properties and characteristics of enzymes that belong to the CE15 family of CAZy database are presented in more detail. The basic principles of X–ray crystallography, employed for the structural study of macromolecules, are also outlined.

The aim of the present work was the heterologous expression in the me-thylotrophic yeast Pichia pastoris, of the proteins PaCE15A and PaCE15B, both of which are Podospora anserine CE15. Crystallization trials of the two proteins were performed, in order to proceed to structural characterization. Monocrys-tals of PaCE15B with satisfactory quality (size, shape and X–ray diffraction po-tency) were obtained in the presence of sodium acetate and ammonium sul-phate salts, at pH 4.6. The crystals were exposed to X–rays, using the synchro-tron radiation source at EMBL Hamburg and preliminary characterization fol-lowed. The 3D structural determination is currently in progress.