Μελέτη τεχνικών απομόνωσης και αξιοποίησης τοξινών από ξενικά είδη ιχθύων

Δήμου, Παναγιώτης; Dimou, Panagiotis

dc.contributor.author	Δήμου, Παναγιώτης	el
dc.contributor.author	Dimou, Panagiotis	en
dc.date.accessioned	2022-01-31T10:39:13Z
dc.date.available	2022-01-31T10:39:13Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/54500
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.22198
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Λαγοκέφαλος	el
dc.subject	Λεοντόψαρο	el
dc.subject	Τετραδοτοξίνη	el
dc.subject	Ενθυλάκωση	el
dc.subject	Ηλεκτροφόρηση	el
dc.subject	L.Sceleratus	en
dc.subject	P.miles	en
dc.subject	Electrospraying	en
dc.subject	Tetradotoxin	en
dc.subject	Encapsulation	en
dc.title	Μελέτη τεχνικών απομόνωσης και αξιοποίησης τοξινών από ξενικά είδη ιχθύων	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Χημική Μηχανική	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2021-10-06
heal.abstract	Στην παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε μελέτη των τεχνικών απομόνωσης και ταυτοποίησης τοξινών για τα ξενικά είδη ιχθύων Lagocephalus sceleratus και Pterois miles (με κοινή ονομασία λαγοκέφαλος και λεοντόψαρο, αντίστοιχα). Στα πλαίσια αξιοποίησης της τοξίνης του λαγοκέφαλου έγινε προσπάθεια ενσωμάτωσής της σε προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας (όπως τα καλλυντικοτεχνικά προϊόντα) αφού προηγουμένως διερευνήθηκε η δυνατότητα ενθυλάκωσής της σε πολυμερική μήτρα μέσω της ηλεκτροϋδροδυναμικής διεργασίας του ηλεκτροστατικού ψεκασμού (electrospraying). Τα είδη Lagocephalus sceleratus (Gmelin, 1789) και Pterois miles (Bennett, 1828) αποτελούν δύο εκ των σημαντικότερων χωροκατακτητικών ξενικών ειδών (ΧΞΕ) των Ελληνικών θαλασσών. Τα χωροκατακτητικά Λεσσεψιανά είδη, εκείνα δηλαδή που εισήλθαν στην Μεσόγειο και στα Ελληνικά ύδατα μέσω της διώρυγας του Σουέζ, έχουν αναπτύξει γρήγορα μεγάλους πληθυσμούς στην Ανατολική Μεσογειακή λεκάνη, ενώ παρουσιάζουν ολοένα αυξανόμενα σημάδια εξάπλωσης στην Κεντρική και Δυτική πλευρά. Ο L.sceleratus αποτελεί ένα από τα πιο τοξικά είδη στον πλανήτη, καθώς οι ιστοί του περιέχουν Τετραδοτοξίνη (TTX), μια νευροπαραλυτική τοξίνη που μπορεί να προκαλέσει τον θάνατο σε περίπτωση κατανάλωσης. Για το λόγο αυτό έχει απαγορευθεί η εμπορία και διάθεση του σε ολόκληρη την Ευρωπαϊκή Ένωση. Σε πολλές περιοχές της Α. Μεσογείου και του Ν. Αιγαίου οι τυχαίες συλλήψεις του είδους αποτελούν συχνά μεγάλο ποσοστό του βάρους της ψαριάς, ιδιαίτερα στην παράκτια αλιεία. Όσον αφορά το λεοντόψαρο P.miles παρότι δεν αποτελεί άμεσο κίνδυνο για την ανθρώπινη ζωή, το συγκεκριμένο είδος είναι επίσης δηλητηριώδες και προκαλεί ένα ευρύ φάσμα συμπτωμάτων συμπεριλαμβανομένου του δυνατού πόνου όταν το δηλητήριό του εγχυθεί μέσω των σκληρών ακανθών των πτερυγίων του. Η άνοδος της θερμοκρασίας της Μεσογείου λόγω της κλιματικής αλλαγής ευνοεί την εξάπλωση των λεσεψιανών εισβολέων. Με την εμπορική αξία και τις δυνατότητες εκμετάλλευσης τους να παραμένουν μηδενικές, χωροκατακτητικά είδη όπως ο λαγοκέφαλος και εν συνεχεία το λεοντόψαρο αποτελούν επιβαρυντικούς παράγοντες για την Ελληνική αλιεία. Η εξεύρεση καινοτόμων μεθόδων για την οικονομική αξιοποίησή τους αποτελεί βασική προϋπόθεση αφενός ώστε να δημιουργηθούν κίνητρα ως προς την στοχευμένη αλίευσή τους και αφετέρου ώστε να επιτευχθεί ο περιορισμός των πληθυσμών τους στις Ελληνικές θάλασσες. Όσον αφορά το λεοντόψαρο P.miles έγινε προσπάθεια απομόνωσης και ταυτοποίησης του δηλητηρίου που περιέχεται στις ακάνθες του. Για το λόγο αυτό μελετήθηκαν δύο διαφορετικά πρωτόκολλα. Το πρώτο πρωτόκολλο αφορούσε την παραλαβή του δηλητηρίου από τα αγκάθια και τους ιστούς της εξωτερικής επιφάνειας και της βάσης του λεοντόψαρου μέσω εκχύλισης με χρήση υπερήχων (Δείγμα Α, Δείγμα Β), ενώ το δεύτερο πρωτόκολλο μελετούσε την παραλαβή του δηλητηρίου από τα αγκάθια του λεοντόψαρου μέσω εκχύλισης υπερήχων-μικροκυμάτων (Δείγμα C). Στην περίπτωση του δείγματος C το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε στόχευε κυρίως στην απομόνωση της καθαρής φωσφολιπάσης A2, η οποία ευθύνεται κατά κύριο λόγο για τη βιολογική δράση του δηλητηρίου. Στη συνέχεια έγινε προσδιορισμός συγκέντρωσης της συνολικής πρωτεΐνης (για τα δείγματα A,B,C) που περιέχεται στις ακάνθες του λεοντόψαρου με χρήση του εξειδικευμένου Pierce BCA Protein Assay Kit με τα αποτελέσματα να δείχνουν ότι η μεγαλύτερη ποσότητα ήταν αυτή του δείγματος Β (6062 (μg πρωτεΐνης)/(g ακάνθων)), ακολουθούμενη από αυτή του δείγματος Α (760 (μg πρωτεΐνης)/(g ακάνθων)) και την αντίστοιχη του δείγματος C (372 (μg πρωτεΐνης)/(g ακάνθων)). Στο επόμενο βήμα πραγματοποιήθηκε ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών μέσω της τεχνικής της ηλεκτροφόρησης σε gel πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) με σκοπό τόσο το διαχωρισμό των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος όσο και τον ποιοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνικών ειδών. Μετά την ηλεκτροφόρηση το gel χρωματίστηκε με ιόντα αργύρου (silver staining) έτσι ώστε να διακρίνονται ευκολότερα οι προκύπτουσες μπάντες των πρωτεϊνών (γραμμές 2-7). Στο δείγμα C παρατηρήθηκε μία μόνο μπάντα γύρω στα 76 kDa (γραμμές 6,7), ενώ οι γραμμές 2 και 3 που αντιστοιχούν στα εκχυλίσματα των ιστών από τη βάση των αγκαθιών (Δείγμα Β) εμφανίστηκαν πολλαπλές μπάντες με πολλά διαφορετικά μοριακά βάρη, γεγονός που υποδηλώνει το πλήθος των πολλών διαφορετικών πρωτεϊνών που υπήρχαν σε αυτό το δείγμα. Τέλος, στις γραμμές 3 και 4 που αντιστοιχούν στα εκχυλίσματα από τις ακάνθες του λεοντόψαρου (Δείγμα A) εμφανίστηκαν περίπου 9 διαφορετικές μπάντες, με πολύ πιο έντονη αυτή στα 77.5 kDa. Σχετικά με το λαγοκέφαλο L.sceleratus, αρχικά προσδιορίστηκε η ΤΤΧ από το μυϊκό ιστό και τα όργανα του ψαριού (νεφρά, χολή, έντερα, ωοθήκες) με χρήση υδατικού διαλύματος οξικού οξέος 0.1 % v/v και μεθανολικού διαλύματος οξικού οξέος 1 % v/v. Οι ηλικίες λαγοκέφαλου που μελετήθηκαν ήταν δύο (2) και τα επιμέρους δείγματα οκτώ (8). Η συγκέντρωση ΤΤΧ προέκυψε έπειτα από την ανάλυση των δειγμάτων με υγρή χρωματογραφία με δίδυμη φασματομετρία μαζών (LC-MS/MS). Καταλληλότερος διαλύτης για τη διεργασία της εκχύλισης αποδείχτηκε το υδατικό διάλυμα οξικού οξέος, ενώ τη μεγαλύτερη συγκέντρωση στο εκχύλισμα την εμφάνισε το δείγμα 6 (0.782 (μg TTX)/(mL δ/τος )) όπου προερχόταν από τα όργανα του θηλυκού λαγοκέφαλου. Μετά την απομόνωση της ΤΤΧ από το L.sceleratus, επόμενος στόχος της εν λόγω διπλωματικής αποτέλεσε η προσπάθεια ενθυλάκωσης της τοξίνης αυτής με σκοπό την αξιοποίησή της σε καλλυντικοτεχνικά προϊόντα (καλλυντικές κρέμες). Η μελέτη εγκλεισμού έγινε με χρήση της ηλεκτροϋδροδυναμικής διεργασίας του ηλεκτροστατικού ψεκασμού (electrospraying) και η πολυμερική μήτρα που χρησιμοποιήθηκε για το σκοπό αυτό ήταν η ζεΐνη. Οι νιφάδες ζεΐνης διαλύθηκαν σε ένα διάλυμα αιθανόλης/νερού (70 % EtOH, 30 % H_2 O) όπου μέσα σε αυτό προστέθηκε η εκχυλισμένη τετραδοτοξίνη συγκέντρωσης 0.782 (μg TTX)/(mL δ/τος ) με την αναλογία μεταξύ τοξίνης-πολυμερικής μήτρας να είναι 1:12. Όσον αφορά τη διεργασία του ηλεκτροστατικού ψεκασμού τα βέλτιστα αποτελέσματα προέκυψαν όταν η επιφάνεια του συλλέκτη τοποθετήθηκε 13 έως 15 cm από το τριχοειδές άκρο, η ογκομετρική παροχή της θέσης 1 κυμαινόταν μεταξύ 200 και 300 μL/h και η τάση κυμαινόταν από 25 έως 27 kV. Η ογκομετρική παροχή του οξικού οξέος (θέση 2) ήταν σταθερή στα 100 μL/h. Ο χαρακτηρισμός του τελικού προϊόντος ενθυλάκωσης πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια μεθόδων Ενόργανης Χημικής Ανάλυσης όπως της Φασματοσκοπίας Εξασθενισμένης Ολικής Ανάκλασης Υπερύθρου (ATR-FTIR), της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (DSC), της Μικροσκοπία Ηλεκτρονικής Σάρωσης (SEM), της Ανάλυσης Μεγέθους Σωματιδίων (Particle Size Distribution) και της Υγρής Χρωματογραφίας-Φασματομετρία Μάζας (LC-MS). Τα αποτελέσματα από το ATR-FTIR υπέδειξαν όλες τις αναμενόμενες κορυφές τόσο για τη ζεΐνη όσο και για την ΤΤΧ. Οι μετρήσεις θερμικής συμπεριφοράς του DSC έδειξαν ότι η θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης T_g της ζεΐνης είναι ίση με 144 ℃, ενώ στο ενθυλακωμένο προϊόν 138 ℃. Κατόπιν επεξεργασίας των εικόνων που προέκυψαν από το SEM βρέθηκε ότι η μέση διάμετρος των σωματιδίων ήταν 540 ±53 nm, η οποία είναι σε πλήρη συμφωνία με την κατανομή μεγέθους σωματιδίων (μέση διάμετρος 473 nm). Τέλος η απόδοση εγκλεισμού υπολογίστηκε ίση με 90%. Η ανάπτυξη και μικροβιολογική ανάλυση καλλυντικών κρεμών έγινε στα πλαίσια διερεύνησης της επίδρασης προσθήκης της εγκλεισμένης ΤΤΧ ως πρόσθετο συστατικό σε τυπική φόρμουλα καλλυντικών κρεμών με σκοπό την υποκατάσταση του συνθετικού μπότοξ με την TTX του λαγοκέφαλου. Για το σκοπό αυτό έγινε προσπάθεια ενσωμάτωσης των σωματιδίων (με την εγκλεισμένη ΤΤΧ από τη διεργασία του electrospraying) σε καλλυντική κρέμα βάσης χωρίς πρόσθετα. Για τις ανάγκες του πειράματος αναλύθηκαν δύο ειδών κρέμας: η κρέμα βάση και η κρέμα βάση με τα εγκλεισμένα σωματίδια ζεΐνης που περιέχουν ΤΤΧ. Για τους σκοπούς της μικροβιολογικής ανάλυσης το υλικό διαχωρίστηκε σε 24 (3x8) μέρη (βαζάκια όγκου 20 mL). Από αυτά τα 12 περιείχαν την κρέμα βάση και τα υπόλοιπα 12 την κρέμα με το εγκλεισμένο υλικό. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασίες 4,25 και 45 ℃ και αναλύθηκαν έπειτα από 15, 30 και 45 ημέρες αντίστοιχα. Τα δείγματα σε όλες τις θερμοκρασίες και χρόνους αποθήκευσης, αναλύθηκαν μικροβιολογικά (ολικό μικροβιακό φορτίο, ζύμες/μούχλες και E.coli) και διαπιστώθηκε ότι πληρούν όλα τα πρότυπα υγιεινής και ασφάλειας. Επίσης, σε κάθε εξεταζόμενο δείγμα μετρήθηκε το pH (διακύμανση από 6.14-7.35), το χρώμα και η ρεολογία των κρεμών. Η μελέτη της ρεολογίας πραγματοποιήθηκε μέσω πειραμάτων ρεολογικών δοκιμών ταλάντωσης (δοκιμές σάρωσης συχνότητας) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της Δυναμικής Μηχανικής Ανάλυσης (DMA). Μέσω του DMA αξιολογήθηκαν οι μεταβολές του συντελεστή αποθήκευσης (G΄), του συντελεστή απώλειας (G΄΄) και του σύνθετου ιξώδους (η*) και διαπιστώθηκε ότι όλες οι κρέμες (ανεξαρτήτως συνθηκών) διατηρούν όλα εκείνα τα χαρακτηριστικά που καθιστούν μια καλλυντική κρέμα αποδεκτή για χρήση.	el
heal.advisorName	Κροκίδα, Μ	el
heal.advisorName	Κροκίδα, Μαγδαληνή	el
heal.committeeMemberName	Κροκίδα, Μαγδαληνή	el
heal.committeeMemberName	Τσόπελας, Φώτιος	el
heal.committeeMemberName	Παυλάτου, Ευαγγελία	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Ανάλυσης, Σχεδιασμού και Ανάπτυξης Διεργασιών και Συστημάτων (ΙΙ)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	138 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false