Ανοσολογικός Προσδιορισμός Βενζο[α]πυρενίου σε Βρώσιμα Έλαια

Abstract

Οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες (ΡΑΗs) αποτελούν μία ομάδα υψηλά λιποφιλικών οργανικών ενώσεων και έχουν προκαλέσει τα τελευταία χρόνια μια αυξανόμενη προσοχή, λόγω των καρκινογενών και μεταλλαξιογόνων ιδιοτήτων τους, καθώς και της παρουσίας τους παντού στο περιβάλλον. Το βενζο[a]πυρένιο (B[a]P) είναι ένα από τα πιο γνωστά καρκινογόνα PAHs και παράγεται κυρίως από την ατελή καύση και πυρόλυση οργανικών υλικών. Έχει επίσης ανιχνευθεί σε καπνό από τσιγάρο, ιζήματα, νερό, αέρα, θαλάσσιους οργανισμούς και τρόφιμα. Το B[a]P μπορεί να εμφανιστεί επίσης και στα βρώσιμα έλαια. Το γεγονός αυτό συνδέεται κυρίως με διάφορους παράγοντες κατά την παραγωγική διαδικασία, όπως χρήση οργανικών διαλυτών για την εκχύλιση του ελαίου από την ελαιόμαζα, έκθεση της ελαιόμαζας σε καυσαέρια ή χρήση υψηλών θερμοκρασιών κατά την εξάτμιση του διαλύτη. Για το λόγο αυτό, το B[a]P έχει αναγνωριστεί ως δείκτης παρουσίας των ΡΑΗs και έχει θεσπιστεί από την Ευρωπαΐκή Επιτροπή το όριο των 2 μg B[a]P ανά kg βρώσιμου ελαίου. Οι μέχρι σήμερα γνωστές μέθοδοι ανάλυσης των PAHs σε βρώσιμα έλαια και λίπη περιλαμβάνουν περίπλοκες, χρονοβόρες και ακριβές διαδικασίες εκχύλισης και στάδια καθαρισμού, ώστε να απομονωθούν τα χαμηλά επίπεδα συγκέντρωσης από τη μήτρα του ελαίου.

Η παρούσα διπλωματική εργασία είχε σκοπό την εύρεση μιας κατάλληλης και γρήγορης μεθόδου εκχύλισης ελαιόλαδου, η οποία να είναι συμβατή με την ανοσολογική μέθοδο ELISA (Enzyme-Linked Ιmmunosorbent Αssay). Η ανάγκη ανάπτυξης μιας τέτοιας μεθόδου έγκειται στο γεγονός ότι η ELISA προσφέρει μια ελκυστική εναλλακτική μέθοδο από τις συμβατικές, λόγω της απλότητας, ταχύτητας, ευαισθησίας και εξοικονόμησης κόστους.

Στο πρώτο μέρος της εργασίας εξετάστηκαν υγρές-υγρές εκχυλίσεις αγορασμένου ελαιόλαδου Κρήτης, της εταιρίας Bio-zentrales GmbH, Ulbering, που χρησιμοποιούνται τόσο σε χρωματογραφικές, όσο και σε ανοσολογικές μεθόδους, αποκλείοντας τα στάδια καθαρισμού. Αρχικά επιχειρήθηκε εκχύλιση ελαίου με μεθανόλη, ακετονιτρίλιο και διάλυμα DMF/νερού (9:1), όμως δεν μπόρεσε να ληφθεί καμπύλη βαθμονόμησης με καμία από αυτές τις μεθόδους. Εν συνεχεία, η εκχύλιση με διάλυμα καφεΐνης/φορμικού οξέος έδωσε μη επαναλήψιμα αποτελέσματα με υψηλή απόκλιση δοκιμής. Κατά την εκχύλιση του ελαίου με DMSO (1:1) αποδείχτηκε ότι η προεκχύλιση του ελαίου με 0,3 Μ HCL/DMSO (1:1) δίνει πιο επαναλήψιμα αποτελέσματα. Διάφορες αραιώσεις του εκχυλίσματος σε 10% μεθανόλη/νερό εφαρμόστηκαν σε αυτή τη μέθοδο, με βέλτιστη την 1:500 και για τα δύο χρησιμοποιηθέντα αντι-B[a]P-αντισώματα 22F12 και 5Ε11. Η καμπύλη βαθμονόμησης έδωσε για το αντίσωμα 22F12 IC50 = 118,62 μg/kg και εύρος εργασίας 35,71-448,52 μg/kg, ενώ για το αντίσωμα 5Ε11 IC50 = 181,01 μg/kg και εύρος μg/kg, ενώ για το αντίσωμα 5Ε11 IC50 = 181,01 μg/kg και εύρος εργασίας 64,07-518,91 μg/kg. Έπειτα, δείγματα ελαίου εμβολιάστηκαν με πρότυπο B[a]P σε συγκεντρώσεις 56, 111, 278 και 556 μg/kg με σκοπό τον καθορισμό των ποσοστών ανάκτησης, τα οποία κυμαίνονταν από 74 μέχρι 104%. Η αραίωση των αντισωμάτων και του αντιγόνου 1,3-βενζο[a]πυρενίου–BSA αντίστοιχα σε κάθε περίπτωση ήταν 1:20000 v/v σε PBS - 1:5000 v/v σε ρυθμιστικό διάλυμα επίστρωσης για το αντίσωμα 22F12 και 1:5000 v/v σε PBS - 1:10000 v/v σε ρυθμιστικό διάλυμα επίστρωσης για το αντίσωμα 5Ε11.

Σε δεύτερο στάδιο επιχειρήθηκε η χρήση στηλών ανεστραμένης και κανονικής φάσης για την εκχύλιση του ελαίου. Η C18-τροποποιημένη Silica στήλη δεν έδωσε επαναλήψιμα αποτελέσματα, ενώ τα αποτελέσματα που λήφθηκαν με τη στήλη SDB–L ενός πολυμερούς που βρίσκεται ακόμα σε ερευνητικό στάδιο της εταιρείας Phenomenex δεν είχαν ικανοποιητικά εύρη εργασίας. Όσον αφορά τις στήλες Silica, εφαρμόστηκαν δύο τρόποι έκλουσης, ένας με εξάνιο και ένας με διχλωρομεθάνιο. Από τους δύο διαλύτες, το εξάνιο αποδείχτηκε προβληματικό. Έτσι, η έκλουση με διχλωρομεθάνιο, έδωσε για το 22F12 IC50 = 45,01 μg/kg με εύρος εργασίας 9,01–249,22 μg/kg και για το 5Ε11 IC50 = 175,27 μg/kg με εύρος εργασίας 33,83–575,63 μg/kg. Οι συνθήκες αντισωμάτων–αντιγόνων για την προαναφερθείσα μέθοδο ήταν 1:5000 v/v σε PBS - 1:1000 v/v σε ρυθμιστικό διάλυμα επίστρωσης για το αντίσωμα 22F12 και 1:2500 v/v σε PBS - 1:5000 v/v σε ρυθμιστικό διάλυμα επίστρωσης για το αντίσωμα 5Ε11. Τέλος, προσδιορίστηκαν τα ποσοστά ανάκτησης για τις στήλες Silica με διχλωρομεθάνιο, τα οποία κυμαίνονταν από 50 μέχρι 85 % για το 22F12 και για εμβολιασμένες συγκεντρώσεις 10, 25, 50, 75 και 100 μg/kg.

Το όριο ανίχνευσης των μεθόδων ήταν υψηλότερο από το ανώτατο επιτρεπτό όριο των 2 μg/kg B[a]P. Το λάδι αποτελείται από μία πολύ περίπλοκη μήτρα, της οποίας τα συστατικά (τριγλυκερίδια, λιπαρά οξέα) περνάνε στο εκχύλισμα και προκαλούν προβλήματα στο ELISA, για αυτό δε λαμβάνονται βαθμονομήσεις ή απαιτούνται υψηλές αραιώσεις που όμως αυξάνουν το εύρος εργασίας. Είναι λοιπόν προφανές ότι απαιτείται ακόμα βελτιστοποίηση των μεθόδων εκχύλισης προς αυτή την κατεύθυνση.

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), a group of highly lipophilic organic compounds, have caused increasing attention in recent years because of their carcinogenicity, mutagenicity and ubiquitousness in the environment. Benzo[a]pyrene (B[a]P) is one of the best known carcinogenic PAHs and it is generally formed by incomplete combustion and pyrolysis of organic materials. It has also been detected in tobacco smoke, sediment, soils, water, air, marine organisms and even food. B[a]P occurs also in edible oils. This is associated with several factors during the production process, like: use of contaminated solvent for extraction of the oil mash, exposure of the mash to gasoline exhaust, or extensive use of heat during solvent evaporation. Therefore, B[a]P is used as an indicator of the presence of PAHs and the European Community has established a maximum residue limit (MRL) of 2 μg/kg B[a]P in edible oils. The known methods of analysis of PAHs in edible oils and fats comprise complex, time consuming and expensive extraction procedures and clean–up steps to isolate the low levels of PAHs present in the oil matrix.

The goal of this thesis was to find a suitable and fast oil extraction procedure that would be compatible with the immunological method of ELISA. The need of the development of such a method stands to the fact that ELISA offers an attractive alternative from the conventional methods, due to the fact that it is simple, fast, sensitive and inexpensive.

In the first part of this work fluid–fluid oil extractions used both for chromatographic and immunological methods were examined, skipping the clean–up steps. At first, oil extractions with methanol, acetonitrile and a mixture of DMF/water (9:1) were attempted. However, no calibration with these methods was possible. Nextly, the caffeine/formic acid extraction gave no reproducible curves with a high inter–assay deviation. During the DMSO - oil (1:1) extraction it was proved, that the pre-extraction of the oil with 0,3 Μ HCL/DMSO (1:1) gives more reproducible results. Different extract dilutions in 10% methanol/water were applied to this method. The most optimal of them for both anti-B[a]P-antibodies 22F12 and 5E11 was the 1:500. The calibration curve gave for the 22F12 antibody a value of IC50 = 118,62 μg/kg and a working range of 35,71-448,52 μg/kg, while for the 5Ε11 antibody a value of IC50 = 181,01 μg/kg and a working range of 64,07-518,91 μg/kg. Then, oil samples were spiked with the B[a]P standard to the concentrations of 56, 111, 278 και 556 μg/kg with the intention of determining the recovery rates, which ranged from 74 to 104 %. The dilution of the antibodies and the antigen conjugate 1,3-B[a]P–BSA were in each case 1:20000 v/v in PBS - 1:5000 v/v in Coating-Buffer for the 22F12 antibody and 1:5000 v/v in PBS - 1:10000 v/v in Coating-Buffer for the 5Ε11 antibody respectively.

In the second step, the use of reversed and normal phase columns for the oil extraction was tested. The C18-modified Silica column had no reproducible results, while the SDB-L column of a proprietary polymer of the company Phenomenex gave calibration curves of unsatisfactory working ranges. Regarding the Silica columns, two ways of elution were applied, one with hexane and one with dichloromethane. From these elution solvents, hexane was proven problematic. For that reason, the elution with dichloromethane (DCM) gave for 22F12 antibody a value of IC50 = 45,01 μg/kg with a working range of 9,01–249,22 μg/kg and for the 5Ε11 antibody a value of IC50 = 175,27 μg/kg with a working range of 33,83–575,63 μg/kg. In this method, the conditions of antibodies–antigen were 1:5000 v/v in PBS - 1:1000 v/v in Coating-for the 22F12 antibody and 1:2500 v/v in PBS - 1:5000 v/v in Coating-Buffer for the 5Ε11 antibody. Finally, recovery rates for this method were determined, with percentages of 50–85 % for the 22F12 and spiked concentrations of 10, 25, 50, 75 and 100 μg/kg.

None of these methods could determine to the maximum residue limit of 2 μg/kg B[a]P. Oil has a very complex matrix, the components of which are extracted along with the B[a]P. These matrix components cause problems to ELISA. For that reason it is impossible to gain calibrations or otherwise a high dilution factor of the oil extract is needed, a step that increases the values of the working range. It is obvious that more optimization of the extraction methods is yet to be done.