Μελέτη του μηχανισμού κατάλυσης δυο καινοτόμων LPMOs για την αποικοδόμηση της λιγνινοκυτταρίνης

Abstract

Η παραγωγή βιοκαυσίμων, και συγκεκριμένα βιοαιθανόλης, από λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα αποτελεί το κέντρο επιστημονικού και βιομηχανικού ενδιαφέροντος τα τελευταία χρόνια. Συγκεκριμένα, για να αποκτήσει βιώσιμο χαρακτήρα η παραγωγή 2ης γενιάς βιοαιθανόλης, η προσπάθεια έχει επικεντρωθεί στη μείωση του ενζυμικού φορτίου και, κατά συνέπεια, του κόστους που προκύπτει κατά τη διαδικασία μετατροπής της βιομάζας σε ζυμώσιμα σάκχαρα. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη του μηχανισμού κατάλυσης δύο καινοτόμων υδατανθρακικών μονοοξυγενασών ((Lytic) Polysaccharide Monooygenases, (L)PMOs ) από του μύκητες Sporotrichum thermophile και Fusarium oxysporum. Για το λόγο αυτό κλωνοποιήθηκαν και εισήχθησαν με επιτυχία στο γονιδίωμα της μεθυλότροφης ζύμης – ξενιστή Pichia pastoris τα αντίστοιχα γονίδια. Και οι δύο πρωτεΐνες περιείχαν το φυσικό σηματοδοτικό πεπτίδιο, με στόχο κατά την έκφρασή τους να εμφανίζουν τη φυσική αλληλουχία στο αμινοτελικό τους άκρο, η οποία συμμετέχει στο συντονισμό του ιόντος χαλκού, που βρίσκεται στο ενεργό τους κέντρο. Πραγματοποιήθηκε βιοπληροφορική ανάλυση, κατά την οποία επιχειρήθηκε η κατάταξη των δύο PMO ανάλογα με την ομολογία που δείχνουν, με τις κατηγορίες PMO που υπάρχουν στη βιβλιογραφία. Έτσι από τα χαρακτηριστικά της αλληλουχίας τους, κατατάχθηκαν στην κατηγορία PMO 3, οι οποίες φαίνεται να οξειδώνουν το γλυκοζιδικό δεσμό στη θέση 1 ή/και στη θέση 4. Μετά την επιτυχή έκφραση και καθαρισμό των δύο PMO, εξετάστηκε η ικανότητά τους να αποδομούν μια ποικιλία σακχαρούχων υποστρωμάτων. Η FoCel61 Native N – terminal εμφάνισε ενεργότητα σε πολυσακχαρίτες όπως η β – γλουκάνη κριθαριού και λιχενάνη, αλλά και σε κελλο-ολιγοσακχαρίτες, όπως η κελλοτετραόζη και η κελλοπενταόζη. Η StCel61 Native N – Terminal δεν εμφάνισε αντίστοιχη ενεργότητα στα υποστρώματα αυτά. Στα υποστρώματα που ανιχνεύθηκε ενεργότητα της FoCel61 Native N –terminal, μελετήθηκε η επίδραση της παρουσίας αναγωγικών παραγόντων όπως του ασκορβικού οξέος, και της δεϋδρογονάσης της κελλοβιόζης (CDH, Pycnoporus cinnabarinus) στη δράση του ενζύμου. Ωστόσο, κανένας από τους αναγωγικούς παράγοντες δεν ενίσχυσε τη δράση της FoCel61 Native N – terminal. Δείγματα από τα πειράματα ανίχνευσης ενεργότητας αναλύθηκαν με τη βοήθεια υγρής χρωματογραφίας ανιονανταλλαγής (HPAEC) με σκοπό την ανίχνευση και ταυτοποίηση των υδατανθρακικών προϊόντων από την αποδόμηση των υποστρωμάτων. Η αδυναμία ανίχνευσης οξειδωμένων προϊόντων στη θέση 1, όπως γλυκονικού οξέος, σε συνδυασμό με την παραγωγή αναγωγικών ολιγοσακχαριτών υποδεικνύει ότι η FoCel61 Native N – terminal οξειδώνει τον άνθρακα στη θέση 4 κατά την διάσπαση του γλυκοζιδικού δεσμού. Κατόπιν εξετάστηκε η συμβολή των ενζύμων αυτών στην αποικοδόμηση λιγνινοκυτταρινούχου υποστρώματος, όπως έλατο το οποίο έχει υποστεί επεξεργασία με ατμό υπό ήπιες όξινες συνθήκες. Από τα πειράματα, διαπιστώθηκε η συνεργιστική δράση του συστήματος StCel61 Native N – Terminal – κλασσικών κυτταρινασών. Η μελέτη επεκτάθηκε και στην StCel61, η οποία περιέχει κάποια επιπλέον αμινοξέα στο αμινοτελικό της άκρο, και η οποία εξετάστηκε σε παλαιότερη έρευνα (Δημαρόγκωνα, 2012). Τα αποτελέσματα έδειξαν πως τα δυο ένζυμα εμφανίζουν εφάμιλλη συνεργιστική δράση όταν προστεθούν σε μίγμα με κλασσικές κυτταρινάσες, αποδεικνύοντας πως η παρουσία αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρο των PMO δεν επηρεάζει την ενεργότητά τους. Η FoCel61 Native N – terminal δεν κατάφερε να ενισχύσει την αποδόμηση του λιγνινοκυτταρινούχου υλικού από τις κυτταρινάσες. Τέλος επιχειρήθηκε η αποδόμηση προκατεργασμένου άχυρου σίτου (PWS), από την StCel61 Native N – terminal σε πιλοτικό αντιδραστήρα ρευστοποίησης, όπως αυτή εκκρίθηκε στο εξωκυτταρικό υγρό της καλλιέργειας (crude). Ωστόσο, δεν μπόρεσε να ανιχνευθεί καμιά επίδραση της PMO στο ιξώδες του PWS, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο της αποδόμησης του υποστρώματος.

Lately, the production of biofuels, and especially bioethanol, from lignocellulosic biomass has been of high scientific and industrial interest. Specifically, in order for the production of second generation bioethanol to become sustainable, the effort is focused on the reduction of enzymatic load and, and as a result, the cost derived from the conversion of biomass into fermentable sugars. The main purpose of this thesis was to study the catalytic mechanism of two novel (lytic) polysaccharide monooxygenases ((L)PMOs) from Sporotrichum thermophile and Fusarium oxysporum. LPMOs are recently discovered biocatalysts which cleave oxidatively polysaccharide substrates. StCel61 and FoCel61 were cloned and heterologously expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Both enzymes were expressed with their natural signal peptide, in order to be secreted with the naturally occuring N – terminal amino acid, which is involved in active site copper coordination. Bioinformatic analysis was carried out, so as to classify the examined enzymes into one of the three PMO categories described in recent literature (Vu et al). Multiple sequence alignment showed that these proteins share the highest homology with PMO3 enzymes, which hydroxylate position C1 and/or C4 of the glucose ring. After the successful expression and purification of both PMOs, their ability to oxidatively cleave a variety of polysaccharide substrates was examined. FoCel61 Native N – terminal showed activity on polysaccharide substrates, such as barley β – glucan and lichenan, but also on cellooligosaccharides, such as cellotetraose and cellopentaose. No activity on these substrates was detected in the case of StCel61 Native N – terminal. The boosting effect of reducing agents such as ascorbic acid and cellobiose dehydrogenase (CDH from Pycnoporus cinnabarinus) on FoCel61 Native N - terminal was also investigated. However, no significant impact on the activity of the examined enzyme was detected. Samples from enzyme activity experiments were analyzed with anion exchange chromatography (HPAEC), in order to detect and identify the carbohydrate products of substrate degradation. The failure to detect gluconic acid in the hydrolyzed products, in combination with the release of oligosaccharides with free reducing ends, indicates that FoCel61 Native N – terminal is specific for C4 oxidation. Subsequently, the contribution of these enzymes into the degradation of lignocellulosic material, such as steam pretreated under weak acidic conditions spruce (PS), was examined. The experimental results confirmed the synergistic effect of StCel61 native N – terminal on common cellulases. This experiment was also performed for StCel61, the same LPMO expressed in a previous work using a different cloning strategy that resulted in a recombinant enzyme with a small number of additional residues at the N – terminal (Dimarogona, 2012). The detected synergism effect was similar, indicating that the presence of additional amino – acids in the PMO N – terminal does not severely affect enzyme function. As far as FoCel61 Native N – terminal is concerned, it could not boost the degradation of lignocellulosic substrate by common cellulases. Finally, biomass decomposition experiments were carried out on pretreated wheat straw (PWS) in the presence of crude StCel61 Native N – terminal, in a pilot liquefaction reactor. No effect of LPMO activity could be detected on PWS viscosity, which was measured as an indicator of substrate depolymerization.