Μελέτη του μύκητα Fusarium oxysporum ως προς την ικανότητα βιοσύνθεσης ενδοκυτταρικού λίπους σε συνθετικά υποστρώματα και ρευστοποιημένα στελέχη γλυκού σόργου

Abstract

Το βιοντίζελ αποτελεί μια ελπιδοφόρα ανανεώσιμη πηγή ενέργειας σαν απάντηση της τρέχουσας κατάστασης που χαρακτηρίζεται από αύξηση της ζήτησης της ενέργειας παγκοσμίως, τη μόλυνση του περιβάλλοντος από την συσσώρευση αερίων του θερμοκηπίου και την επικείμενη εξάντληση των ορυκτών καυσίμων. Κατά κύριο λόγο, παράγεται μέσω αλκαλικής μετεστεροποιήσης των τριγλυκεριδίων που περιέχονται σε έλαια φυτικής ή ζωικής προέλευσης. Τα τελευταία χρόνια κερδίζει έδαφος η έρευνα για χρήση λίπους μικροβιακής προέλευσης στην παραγωγή βιοντίζελ αλλά και σε άλλες εφαρμογές. Η συσσώρευση λιπιδίων στους ελαιογόνους μικροοργανισμούς, αποτελεί παράδειγμα δευτερογενούς αναβολικής δραστηριότητας και συμβαίνει σε συνθήκες περιορισμού αζώτου και περίσσεια πηγής άνθρακα. Επίσης, σημαντική παράμετρο αποτελεί και η δυνατότητα χρήσης λιγνινοκυταρινούχας βιομάζας σαν υπόστρωμα για τις ζυμώσεις για παραγωγή μικροβιακών ελαίων, έναντι βρώσιμων καλλιεργειών. Στην παρούσα μελέτη έγινε η διερεύνηση για την ικανότητα ανάπτυξης και παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους για το μύκητα Fusarium oxysporum σε καθαρές πηγές και σε ρευστοποιημένα στελέχη γλυκού σόργου. Όλες οι ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν ήταν ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα. Για την περίπτωση των καθαρών πηγών, αρχικά έγινε η προσπάθεια εύρεσης της βέλτιστης πηγής άνθρακα ανάμεσα στα σάκχαρα που περιέχονται στο γλυκό σόργο δηλαδή γλυκόζη, φρουκτόζη, σακχαρόζη και μείγμα τους σε αρχική συγκέντρωση 40 g/L και σε λόγο C/N ίσο με 100. Προέκυψε ότι καλύτερη πηγή άνθρακα αποτελεί το μείγμα των τριών σακχάρων με παραγωγή λίπους 3,3 g/L και ποσοστό λιπιδίων επί ξηρής βιομάζας ίσο με 52,93%. Στη συνέχεια έγινε εύρεση της βέλτιστης πηγής αζώτου. Χρησιμοποιήθηκαν οργανικές πηγές αζώτου: ουρία, πεπτόνη και yeast extract και ανόργανες: χλωριούχο αμμώνιο (NH4Cl), θειικό αμμώνιο ((NH4)2SO4) και όξινο φωσφορικό αμμώνιο (NH4)2HPO4. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα σακχαρόζης, γλυκόζης και φρουκτόζης με αρχική συγκέντρωση 40 g/L σε λόγο C/Ν ίσο με 100. Την καλύτερη απόδοση από άποψη ποσότητας λίπους έδωσε το yeast extract με παραγωγή λίπους 3,67 g/L και ποσοστό λιπιδίων επί ξηρής βιομάζας ίσο με 49,50%. Τέλος, έγινε έλεγχος για την εύρεση του βέλτιστου λόγου C/N, με χρήση του μείγματος των τριών σακχάρων σαν πηγή άνθρακα σε σταθερή συγκέντρωση 40 g/L και το yeast extract σαν πηγή αζώτου. Ο βέλτιστος λόγος C/N για την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους ήταν ο 50 με μέγιστη παραγωγή λίπους 3,84 g/L και ποσοστό λιπιδίων επί ξηρής βιομάζας ίσο με 37,76%. Βέβαια να σχολιαστεί ότι η απόδοση σε λίπος που αντιστοιχεί στο λόγο 50 είναι πολύ κοντινή με την τιμή 3,67 g/L που είναι η απόδοση για το λόγο 100, γεγονός που υποδηλώνει ότι η διαφορά στο λόγο δεν έχει μεγάλη επίδραση στην παραγωγή λίπους. Στην περίπτωση χρησιμοποίησης του γλυκού σόργου σαν υπόστρωμα, αρχικά έγινε η προσπάθεια διερεύνησης για το εάν μπορεί ο μύκητας να αξιοποιήσει το πρωτεινικό άζωτο που περιέχεται στο σόργο ή όχι, πραγματοποιώντας πειράματα με και χωρίς προσθήκη πηγής αζώτου, η οποία ήταν το yeast extract καθώς αυτό είχε βγάλει τα καλύτερα ποσοτικά αποτελέσματα λίπους στις καθαρές πηγές. Προέκυψε ότι η προσθήκη αζώτου, δεν έχει επίδραση στην ποσότητα των παραγόμενων λιπιδίων καθώς και στις δυο περιπτώσεις το λίπος που συσσωρεύτηκε ανέρχεται στα 1,91 g/L. Στα παραπάνω πειράματα η συγκέντρωση των στερεών ήταν 8,69%. Στη συνέχεια για την ίδια συγκέντρωση στερεών, διερευνήθηκε η επίδραση της προσθήκης ενζύμων για την υδρόλυση της κυτταρίνης και προέκυψε ότι η ενζύμικη υδρόλυση είναι σημαντική καθώς χωρίς αυτή, η απόδοση σε απόδοση σε ποσότητα λίπους ήταν ιδιαίτερα χαμηλή (0,71 g/L). Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση της αύξησης της συγκέντρωσης των στερεών στο μέσο της καλλιέργειας και συγκεκριμένα δοκιμάστηκαν οι συγκεντρώσεις 12% και 16%. Προέκυψε ότι με αύξηση της μειώνεται σημαντικά και η ποσότητα των παραγόμενων λιπιδίων. Tέλος, πραγματοποιήθηκαν δυο πειράματα με χρήση Liquid Fraction (υγρό κλάσμα από την κατεργασία άχυρου σίτου) σαν υπόστρωμα με και χωρίς προσθήκη πηγής αζώτου, η οποία ήταν το yeast extract. Σαν αποτέλεσμα, μικροοργανισμός δεν σημείωσε ικανοποιητική ανάπτυξη και η παραγωγή μικροβιακού λίπους έφτασε τα 0,55 g/L και 0,57 g/L αντίστοιχα για κάθε περίπτωση.

Biodiesel is a promising renewable energy source in response to the current situation which includes an increase in the energy demand world-wide, environmental pollution by the accumulation of greenhouse gases and the impending depletion of fossil fuels. Primarily it is produced by alkaline transesterification of triacylglycerols of vegetable or animal origin. In recent years several researchers have evaluated the production and the use of microbial oil for biodiesel production and other applications. Lipid accumulation in oleaginous microorganisms typically occurs during secondary metabolic growth, in nitrogen-limited conditions and in the presence of high amounts of sugars. An important parameter is also the possibility of the use of lignocellulosic material as substrate for fermentations for microbial oil production, instead of using edible crops. The aim of the present study was to investigate the ability of the fungus Fusarium oxysporum to accumulate intracellular lipid grown on synthetic media and media containing liquefied sweet sorghum stalks. Batch cultivations were carried out at a rotary shaker. In the case of synthetic media, the use of the sugars contained in sweet sorghum, namely glucose , fructose , sucrose and mixture of them was evaluated in order to find which of them can induce higher lipid production. Initial sugar concentration was adjust of 40 g/L, while the C/N ratio was 100. The results showed that the best carbon source is the mixture of the three sugars and more specifically concentration of SCO reached 3,3 g/L giving a yield of 52.93%. Subsequently, the effect of the nitrogen source was evaluated. Both organic and inorganic sources were tested. More specifically organic sources of nitrogen were: urea, peptone and yeast extract, and the inorganic were: ammonium chloride (NH4Cl), ammonium sulphate ((NH4)2SO4) and diammonium phosphate (NH4)2HPO4. The carbon source used was a mixture of sucrose, glucose and fructose at an initial concentration of 40 g/L, while the C/N ratio was 100. The best results in terms of intracellular lipid concentration were obtained when yeast extract was used, as SCO reached 3,67 g/L giving a yield of 49,50% w/w. Finally, the optimal ratio C/N was examined using a mixture of three sugars as carbon source at a concentration of 40 g/L and yeast extract as nitrogen source. The optimum ratio C/N in terms of concentration of intracellular lipid was 50 as SCO reached 3,84 g/L with a yield of 37,76% w/w. This value of SCO production is very close the SCO production achieved when C/N ratio is 100 (3,67 g/L), suggesting that C/N ratio has not a significant effect on lipid accumulation. When using media containing liquefied sweet sorghum stalks as a substrate, the ability of fungus to utilize the nitrogen (as protein) contained in sorghum was tested. For this reason, experiments with and without addition of nitrogen source were carried out. The nitrogen source used was yeast extract as it showed best results during the previous series of experiments. The results showed that addition of nitrogen has no effect on the quantity of lipids accumulated, as in both cases SCO production reached 1,91 g/L. The initial concentration of sweet sorghum stalks was 8,69 %. Subsequently, using the same initial concentration of sorghum stalks, the effect of enzymatic hydrolysis of cellulose was examined and results showed that SCO obtained without hydrolysis is very low (0,71 g lipids /L), implying that hydrolysis before fermentation has a positive effect on lipid accumulation. Finally, the effect of increasing the amount of sorghum stalks in the culture medium was tested, using concentrations of 12% and 16 %. Results showed that the increase of sorghum stalks reduced significally the amount of lipid accumulated.