Αξιολόγηση του ενζυμικού συστήματος του μύκητα Sporotrichum thermophile για την αποτελεσματική υδρόλυση λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας

Αντωνοπούλου, Ιώ; Antonopoulou, Io

dc.contributor.author	Αντωνοπούλου, Ιώ	el
dc.contributor.author	Antonopoulou, Io	en
dc.date.accessioned	2014-10-21T09:01:21Z
dc.date.available	2016-02-08T12:29:29Z
dc.date.issued	2014-10-21
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/39287
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.11802
dc.rights	Default License
dc.subject	Ενζυμική υδρόλυση	el
dc.subject	Λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα	el
dc.subject	Βιοκαύσιμα	el
dc.subject	Βιοαιθανόλη	el
dc.subject	Θερμόφιλα ένζυμα	el
dc.subject	Myceliopthora thermophila	en
dc.subject	Bioethanol	en
dc.subject	Sporotrichum thermophile	en
dc.subject	Lignocellulosic biomass	en
dc.subject	CAZy	en
dc.title	Αξιολόγηση του ενζυμικού συστήματος του μύκητα Sporotrichum thermophile για την αποτελεσματική υδρόλυση λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας	el
dc.title	Evaluation of the enzymatic system of the fungus Sporotrichum thermophile for an efficient hydrolysis of lignocellulosic biomass	en
dc.contributor.department	Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογικές διεργασίες	el
heal.classification	Μικροβιακή βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.classification	Chemical engineering	en
heal.classification	Χημική τεχνολογία και μηχανική	el
heal.classificationURI	http://localhost:8080/healp/data/11/2/6
heal.classificationURI	http://localhost:8080/healp/data/11/2/12
heal.classificationURI	http://id.loc.gov/authorities/subjects/sh00007765
heal.classificationURI	http://id.loc.gov/authorities/subjects/sh85022900
heal.classificationURI	http://localhost:8080/healp/data/11/3
heal.language	el
heal.access	free	el
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2014-01-01
heal.abstract	Στην παρούσα διπλωματική εργασία, αξιολογήθηκε το ενζυμικό σύστημα του θερμόφιλου μύκητα Sporotrichum thermophile ATCC 42464, ως προς την ικανότητα υδρόλυσης λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός του γονιδιώματος του μύκητα με τη χρήση βιοπληροφορικών εργαλείων, αποσκοπώντας στην εκτίμηση των περιεχόμενων λιγνινοκυτταρινολυτικών αλληλουχιών. Συγκεκριμένα, εντοπίστηκαν 26 αλληλουχίες με ενεργότητα κυτταρινάσης (β-1,4-ενδο-γλουκανάσης, β-1,4-εξω-γλουκανάσης αναγωγικών και μη αναγωγικών άκρων, β-γλυκοζιδάσης και εξω-1,4-β-γλυκοζιδάσης), 43 αλληλουχίες με ενεργότητα ημικυτταρινάσης που δρα σε ξυλάνη (β-1,4-ενδο-ξυλανάσης, β-ξυλοζιδάσης, α-L-αραβινοφουρανοζιδάσης, ενδο-1,5-α-L-αραβινάσης, α-1,2-ξυλανο-γλουκουρονοζιδάσης, ακετυλο-εστεράσης της ξυλάνης, εστεράσης του φερουλικού οξέος) και 25 αλληλουχίες βοηθητικών ενεργοτήτων (αφυδρογονάσης της κελλοβιόζης και λυτικής μονο-οξυγενάσης πολυσακχαριτών). Από το συνολικό λιγνινοκυτταρινολυτικό σύστημα του μύκητα, το 80,9% κατευθύνεται προς το μονοπάτι έκκρισης, ενώ το 13,9% δεν εκκρίνεται. Από τις εντοπισμένες εκκρινόμενες λιγνινοκυτταρινολυτικές αλληλουχίες, μόλις το 15,9% διαθέτει μονάδα πρόσδεσης στην κυτταρίνη, ενώ η συντριπτική πλειοψηφία της τάξης του 93,5% υφίσταται Ν- ή/και Ο-γλυκοζυλίωση. Το μέσο ισοηλεκτρικό σημείο των εκκρινόμενων λιγνινοκυτταρινολυτικών αλληλουχιών είναι 5,62±0,77, ενώ το μέσο μοριακό βάρος είναι 40618±15928. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση των συνθηκών ανάπτυξης του μύκητα S. thermophile για την αποτελεσματική παραγωγή εξωκυτταρικών κυτταρινασών και κατόπιν διεξήχθη μελέτη του παραχθέντος εξωκυτταρικού πολύ-ενζυμικού διαλύματος. Βέλτιστη πηγή άνθρακα βρέθηκε ότι αποτελεί το υπόλειμμα βύνης, ενώ βέλτιστη πηγή αζώτου βρέθηκε ότι αποτελεί το θειικό αμμώνιο, σε συγκεντρώσεις 7,0 % w/v και 0,4% w/v, αντίστοιχα. Μέγιστη ολική ενεργότητα κυτταρινασών (Filter Paper Activity, FPA), η οποία μετρήθηκε ίση με 0,37±0,013 FPU/mL, επιτεύχθηκε την 5η ημέρα υγρής καλλιέργειας του μύκητα στις προαναφερθείσες συνθήκες. Ακολούθως, μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας και του pH στην ολική ενεργότητα κυτταρινασών του πολυ-ενζυμικού διαλύματος, όπου βέλτιστες τιμές δράσης βρέθηκαν να είναι οι 65oC και pH 5,5. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα μελέτης της θερμικής σταθερότητας του ενζυμικού διαλύματος, στους 65oC o χρόνος ημιζωής των περιεχόμενων κυτταρινασών ήταν 0,98 h, ενώ η σταθερά θερμικής απενεργοποίησης kd προσδιορίστηκε ίση με 3,95•10-2 h-1. Αντίστοιχα, στους 60oC, ο χρόνος ημιζωής ήταν 27 h, και η σταθερά απενεργοποίησης, 2,09•10-2 h-1. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης επίδρασης της θερμοκρασίας στο ρυθμό υδρόλυσης κυτταρίνης (Whatman No1), μέγιστη απόδοση υδρόλυσης από το ενζυμικό διάλυμα του μύκητα επιτεύχθηκε ύστερα από 24 h επώασης στους 60oC. Με βάση τα παραπάνω, βέλτιστη θερμοκρασία για την υδρόλυση κυτταρίνης από το ενζυμικό διάλυμα του μύκητα S. thermophile είναι οι 60oC, στο pH βέλτιστης δράσης κυτταρινασών (pH=5,5). Η θερμοκρασία αυτή είναι ιδανική για εφαρμογή σε διεργασίες Διακριτής Υδρόλυσης και Ζύμωσης (Separate Hydrolysis & Fermentation, SHF). Ακόμη, εκτιμήθηκε η ανθεκτικότητα κυτταρίνης (Whatman No1) και κατεργασμένης κυτταρίνης με ιοντικά υγρά (Sigma). Η σταθερά Krec υπολογίστηκε ίση με 5,46 και 2,69 για την αδιάλυτη κυτταρίνη και την κυτταρίνη κατεργασμένη με ιοντικά υγρά, αντίστοιχα. Τέλος, δύο διαφορετικές διεργασίες παραγωγής βιοαιθανόλης αξιολογήθηκαν, χρησιμοποιώντας ως πρώτη ύλη υδροθερμικά κατεργασμένο άχυρο σίτου (26% w/w DM) και το ενζυμικό διάλυμα του μύκητα S. thermophile (7 FPU/g DM) για την υδρόλυση βιομάζας: μία διεργασία SHF, που περιέλαβε τη ρευστοποίηση και σακχαροποίηση της βιομάζας για 24 h σε αντιδραστήρα ρευστοποίησης και τη μετέπειτα ζύμωσή του από τη ζύμη Saccharomyces cerevisiae σε φιάλες, και μία διεργασία Ταυτόχρονης Υδρόλυσης και Ζύμωσης (Pre-hydrolysis Simultaneous Saccharification & Fermentation, PSSF), που περιέλαβε τη ρευστοποίηση της βιομάζας για 6 h και τη μετέπειτά ζύμωση σε φιάλες. Και στις δύο διεργασίες εφαρμόστηκαν δύο διαφορετικές θερμοκρασίες (50oC και 60οC). Μέγιστη απόδοση υδρόλυσης (29,37±0,10%) επιτεύχθηκε ύστερα από 24 h επώασης στους 60oC. Μέγιστη σχετική απόδοση αιθανόλης (23,77±0,43%) επιτεύχθηκε την 3η ημέρα ζύμωσης σε άχυρο σίτου που είχε υποστεί σακχαροποίηση για 24 h στους 60οC, ενώ μέγιστη παραγωγικότητα σε αιθανόλη επιτεύχθηκε σε άχυρο σίτου που είχε υποστεί ρευστοποίηση για 6 h στους 60oC (0,29±0,061g/kg h). Ακόμη, διερευνήθηκε η δυνατότητα ενίσχυσης του ενζυμικού διαλύματος του μύκητα με ενεργότητα β-γλυκοζιδάσης, με προσθήκη του εμπορικού ενζυμικού σκευάσματος Novozym 188 ή με ανάκτηση των εσωκυτταρικών β-γλυκοζιδασών του μύκητα, ύστερα από ανάπτυξή του σε πίτυρο σίτου.	el
heal.abstract	Aim of this present diploma thesis is the evaluation of the enzymatic system of the thermophilic fungus Sporotrichum thermophile ATCC 42464 as for its ability to hydrolyze lignocellulosic biomass. The fungus’ genome was annotated with the use of various bioinformatics tools, in order to estimate the containing lignocellulolytic sequences. In particular, 26 sequences with cellulase activity (containing b-1,4-endo-glucanase, b-1,4-exo-glucanase-reducing, non-reducing end, b-glucosidase and exo-1,4-b-glucosidase activities), 43 sequences with hemicellulase activity hydrolyzing xylan (containing b-1,4-endo-xylanase, b-xylosidase, a-L-arabinofuranosidase, endo-1,5-a-L-arabinase, xylan α-1,2-glucuronosidase, acetyl xylan esterase and feruloyl esterase activities) and 25 sequences of auxiliary activities (cellobiose deacetylase and lytic polysaccharide monooxygenase activites) were detected. From the overall lignocellulolytic system of the fungus, the 80.9% is destined towards the secretory pathway, while the 13.9% is not secreted. From the detected secreted lignocellulolytic sequences, only the 15.9% contains a cellulose binding domain, while the vast majority of 93.5% undergoes N- and/or O- glycosylation. The average theoretical isoelectric point of the secreted lignocellulolytic sequences is 5.62±0.77, while the average theoretical molecular weight is 40618±15928. Optimization of the growth conditions of the fungus S. thermophile was conducted, aiming to the effective production of extracellular cellulases, and a subsequent study of the produced extracellular multi-enzyme extract was held. Optimal carbon source was found to be brewer’s spent grain, while optimal nitrogen source was ammonium sulfate at a concentration of 7.0% w/v and 0.4% w/v respectively. Highest filter paper activity (FPA), which was measured equal to 0.37±0.013 FPU/mL, was achieved the 5th day of the submerged culture at the aforementioned conditions. The effect of temperature and pH on the multi-enzyme extract’s cellulase activity was evaluated and optimal conditions for achieving highest filter paper activity (FPA) were determined to be 65οC and pH 5.5. According to the results of extract’s thermal stability study, at 65οC the half-life (t1/2) of the containing was 0,98 h and its thermal deactivation constant kd was 3,95•10-2 h-1. Similarly, at 60οC the half-life was 27 h and the thermal deactivation constant kd was 2,09 •10-2 h-1. According to the results of the temperature effect study on the hydrolysis rate of cellulose (Whatman No1), highest hydrolysis yield by the multi-enzyme extract was achieved after 24 h of incubation at 60οC (31,42±1,90%). Based on the above, optimal temperature for the hydrolysis of cellulose by the S. thermophile’s multi-enzyme extract is 60οC at the pH of optimal FPA activity (pH=5.5). The implementation of this temperature at Separate Hydrolysis & Fermenation (SHF) processes is ideal. Also, the recalcitrance of cellulose (Whatman No1) and pretreated cellulose with ionic liquids (Sigma) towards the multi-enzyme extract was studied. The Krec constant was calculated equal to 5.46 and 2.69 for cellulose and pretreated cellulose, respectively. Finally, two different bioethanol production processes were evaluated, using hydrothermally pretreated wheat straw (26% w/w DM) as biomass resource and the S. thermophile’s multi-enzyme extract (7 FPU/g DM) for its hydrolysis: a SHF process, including a biomass saccharification step for 24 h and then fermentation by the yeast Saccharomyces cerevisiae in flasks and, a Pre-Hydrolysis Simultaneous Saccharification & Fermentation (PSSF) process including a pro-hydrolysis step for 6 h and the subsequent biomass’ fermentation in flasks. For both processes two different temperatures were tested (50oC and 60οC). Highest hydrolysis yield (29,37±0,10%) was achieved after 24 h of incubation at 60οC. Highest ethanol relative yield (23,77±0,43%) was achieved on the 3rd day of fermentation for wheat straw hydrolyzed for 24 h at 60οC. Highest bioethanol productivity was achieved for wheat straw undergone pre-hydrolysis for 6 h at 60οC (0,29±0,061g/kg h). The possibility of enhancing the fungus’s extract with b-glucosidase activity was examined, by adding the commercial enzyme solution Νοvozym 188 or retrieving the fungus’ intracellular b-glucosidases, after its submerged culture on wheat bran.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Κολίσης, Φραγκίσκος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	231 σ.	el
heal.fullTextAvailability	true