Βιοσυμβατότητα μαγνητικών νανοσοματιδίων οξειδίου του σιδήρου σε μορφή γέλης με τα έμμορφα στοιχεία του αίματος

Abstract

Τα τελευταία χρόνια τα μεταλλικά νανοσωματίδια (ΝΣ) αλλά και διάφορα οξείδιά τους, ιδιαίτερα το οξείδιο του σιδήρου (Fe2O3 ή Fe3O4), χρησιμοποιούνται στην Ιατρική για διαγνωστικούς και θεραπευτικούς σκοπούς. Τα ΝΣ οξειδίου του σιδήρου είναι ευρέως διαδεδομένα επειδή μπορούν να παρασκευαστούν σε διάφορες μορφολογίες (όπως σφαίρες, κύλινδροι και κύβοι), υπάρχει η δυνατότητα να τροποποιηθούν οι επιφανειακές τους ιδιότητες, προκειμένου να αποφευχθούν οι μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις, κατά κανόνα παρουσιάζουν υπερπαραμαγνητική συμπεριφορά ενώ, τέλος, είναι βιοσυμβατά. Η βιοσυμβατότητά τους και ο μεγάλος λόγος επιφάνειας/όγκο, τα καθιστούν ελκυστικά για χρήση σε in vivo εφαρμογές, όπως η μαγνητική τομογραφία, η στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων και η υπερθερμία. Παρά τα σημαντικά πλεονεκτήματα, υπάρχει ένα βασικό μειονέκτημα το οποίο είναι η ανοσοσυμβατότητα, ένας όρος που χρησιμοποιείται για να περιγράψει τη συμβατότητα με το ανοσοποιητικό σύστημα. Πιο συγκεκριμένα, ο όρος ανοσοσυμβατότητα χρησιμοποιείται για να περιγράψει την αντίδραση του οργανισμού όταν το ΝΣ αναγνωριστεί από το ανοσοποιητικό σύστημα, μετά από κάποιο χρονικό διάστημα κυκλοφορίας στο καρδιαγγειακό σύστημα. Το χρονικό διάστημα αυτό εξαρτάται από τα φυσικά χαρακτηριστικά του ΝΣ και καθορίζει το χρόνο παραμονής του ΝΣ στον οργανισμό. Στα πλαίσια της προσπάθειας να καταστούν τα ΝΣ ανοσοσυμβατά και να αυξηθεί ο χρόνος παραμονής τους στο καρδιαγγειακό σύστημα, αναπτύχθηκαν σχετικά πρόσφατα μερικές νέες μορφολογίες ΝΣ. Αυτές οι νέες μορφολογίες νανοσκοπικών διαστάσεων αποτελούνται από βιοσυμβατά σταυροδεμένα πολυμερή (νανογέλη), τα οποία συμπεριφέρονται σαν κάψουλες-φορείς στα οποία μπορεί να προσδεθεί είτε ποσότητα από ΝΣ οξειδίου του σιδήρου, είτε ποσότητα φαρμάκου για στοχευμένη χορήγηση. Τέτοιες οικογένειες βασίζονται στα πολυμερή poly (N-vinylcaprolactam) (PVCL) και poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) ενώ τελευταία έχουν αναπτυχθεί παρόμοιες νανοσκοπικές κάψουλες-φορείς που βασίζονται στο poly (N,N′-diethyl aminoethyl methacrylate) (PDEAEMA). Τα συγκεκριμένα συστήματα παρουσιάζουν απόκριση σε μεταβολές εξωτερικών παραμέτρων όπως είναι η θερμοκρασία και το pH, οπότε και συρρικνώνονται, όταν η θερμοκρασία ή το pH υπερβούν μια συγκεκριμένη τιμή, απελευθερώνοντας το έγκλεισμα που αρχικά τοποθετήθηκε μέσα σε αυτά. Οι κρίσιμες θερμοκρασίες μετάβασης είναι κοντά στους 40ο C, ενώ αντίστοιχα οι κρίσιμες τιμές του pH κοντά στο 7, τιμές που βρίσκονται εντός του εύρους που απαιτείται για χρήση σε in vivo εφαρμογές. Ο σκοπός της παρούσης Μεταπτυχιακής Εργασίας είναι η μελέτη της μαγνητικής νανογέλης (ΜΝΓ) που αποτελείται από το σταυροδεμένο πολυμερές από PDEAEMA (νανογέλη) και από ΝΣ οξειδίου του σιδήρου (Fe2O3 ή Fe3O4) με τα έμμορφα στοιχεία του αίματος. Η μελέτη βασίζεται στην παρατήρηση αλλοιώσεων των μορφολογικών χαρακτηριστικών των κυττάρων του αίματος με προηγμένες τεχνικές απεικόνισης, τη Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης (ΜΑΔ) και τη Μικροσκοπία Ηλεκτρονικής Σάρωσης (ΜΗΣ). Η Οπτική Μικροσκοπία (ΟΜ) χρησιμοποιείται σε μικρότερο βαθμό και μόνο κατά το στάδιο προετοιμασίας των δειγμάτων για τον έλεγχο της καταλληλότητάς τους για την περαιτέρω μελέτη με τις μεθόδους ΜΑΔ και ΜΗΣ. Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δείγματα περιφερικού αίματος από 3 υγιείς και 2 ασθενείς δότες. Στα in vitro πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στην παρούσα Μεταπτυχιακή Εργασία διερευνήθηκαν μια σειρά από πειραματικές παραμέτρους. Συγκεκριμένα, τα δείγματα περιφερικού αίματος, ωρίμασαν με τη ΜΝΓ για (α) διαφορετικούς χρόνους, (β) διαφορετικές συγκεντρώσεις και (γ) διαφορετικό μέσο. Μετά την ωρίμανση παρασκευάστηκαν μονοστρωματικά υμένια δείγματος, τα οποία παρατηρήθηκαν στα προηγμένα ΜΑΔ και ΜΗΣ, που έχουν δυνατότητα μεγέθυνσης έως και x1.000.000 φορές. Οι μεγάλες μεγεθύνσεις που προσφέρουν τα προηγμένα μικροσκόπια είναι απαραίτητες για τη μελέτη, προκειμένου να διερευνηθούν με μεγάλη ακρίβεια (α) οι πιθανές αλλοιώσεις όχι μόνο στη γενική μορφολογία και σχήμα των κυττάρων αλλά και στη μορφολογία της μεμβράνης τους (κάτι που αναμένεται να συμβεί σε πρώιμο στάδιο) και (β) η πιθανή σύζευξη της ΜΝΓ με τα κύτταρα. Εκτός από αυτούς τους δείκτες, επικεντρώσαμε και στην πιθανότητα (α) λύσης κυρίως των ερυθροκυττάρων (ΕΚ), (β) στη φαγοκυττάρωση της ΜΝΓ από τα λευκοκύτταρα (ΛΚ) και (γ) στη δημιουργία συσσωματωμάτων στα αιμοπετάλια (ΑΠ), θεωρώντας και αυτούς ως δείκτες βιοσυμβατότητας. Τα αποτελέσματα κατηγοριοποιούνται για τις τρεις ομάδες κυττάρων περιφερικού αίματος. Τα ΕΚ αποτελούν το πιο σημαντικό κομμάτι της μελέτης, λόγω του ότι αποτελούν τον πληθυσμό πλειονότητας στο αίμα και ενδεχομένως έχουν μεγαλύτερες πιθανότητες αλληλεπίδρασης με τη ΜΝΓ. Φαίνεται ότι τα ΕΚ δεν επηρεάζονται μορφολογικά από την παρουσία της ΜΝΓ τόσο μετά την ωρίμανση σε πλάσμα, όσο και σε φυσιολογικό ορό. Η πιο σημαντική παρατήρηση είναι ότι υπάρχει σύζευξη με τη ΜΝΓ, η οποία συγκεντρώνεται κυρίως περιμετρικά του ΕΚ. Η παρατήρηση της σύζευξης είναι ευκολότερη όταν η ωρίμανση γίνεται σε φυσιολογικό ορό. Αφού επιτευχθεί η σύζευξη, και με τη χρήση ενός μαγνητικού πεδίου, το ΕΚ μπορεί με ακρίβεια να οδηγηθεί στον ιστό-στόχο. Στη συνέχεια η ΜΝΓ μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως σκιαγραφικός παράγοντας (για τη Μαγνητική Τομογραφία) ή για ελεγχόμενη χορήγηση φαρμάκου (για την στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων). Τα ΛΚ, είναι τα κύτταρα εκείνα που ενεργοποιούνται για να απομακρύνουν τα ξένα σώματα και τους παθογόνους οργανισμούς μέσω της διαδικασίας που ονομάζεται φαγοκυττάρωση. Τα προκαταρκτικά αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ΛΚ δεν αλληλεπιδρούν με τη ΜΝΓ, ούτε και να επηρεάζεται η μορφολογία τους από την παρουσία της, όταν η ωρίμανση γίνεται σε πλάσμα. Αντίθετα, όταν η ωρίμανση γίνεται σε φυσιολογικό ορό, τα ΛΚ καταστρέφονται λόγω των διαδικασιών όσμωσης στις οποίες υπόκεινται λόγω της παρουσίας του. Τα αποτελέσματα είναι ενθαρρυντικά επειδή δείχνουν ότι η ΜΝΓ μπορεί να έχει αυξημένο χρόνο κυκλοφορίας στο καρδιαγγειακό χωρίς να αναγνωρίζεται από το ανοσοποιητικό σύστημα αλλά και ότι δεν επηρεάζει τη λειτουργία των ΛΚ όταν η ωρίμανση γίνεται σε πλάσμα. Τα ΑΠ, παρά το πολύ μικρό ποσοστό που καταλαμβάνουν στο αίμα, μόλις 1%, έχουν πολύ χρήσιμο ρόλο στον οργανισμό λόγω του χαρακτηριστικού της συγκόλλησης που παρουσιάζουν μεταξύ τους, καθορίζοντας έτσι την αιμόσταση. Κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες, αυτό το χαρακτηριστικό είναι επιθυμητό, για παράδειγμα στην επούλωση ενός τραύματος. Ωστόσο χρειάζεται να μελετηθεί η επίδραση της ΜΝΓ στην ιδιότητάς τους αυτή, προκειμένου να αποκλειστεί το ενδεχόμενο δημιουργίας θρόμβων στο αίμα. Τα αποτελέσματα της μελέτης δείχνουν ότι τα ΑΠ δεν αλληλεπιδρούν με τη ΜΝΓ όταν η ωρίμανση γίνεται σε πλάσμα, μιας και δεν παρατηρούνται μεταβολές στη συγκόλληση μεταξύ τους, ούτε και αλλοιώσεις στη μορφολογία τους. Αντίθετα, τα ΑΠ καταστρέφονται, όπως και τα ΛΚ, κατά την ωρίμανση τους με τη ΜΝΓ σε φυσιολογικό ορό. Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα αυτών των in vitro πειραμάτων συμπεραίνουμε ότι η ΜΝΓ είναι καταρχήν βιοσυμβατή για τις συνθήκες που μελετήθηκαν στα πλαίσια της Μεταπτυχιακής Εργασίας, μιας και δεν φαίνεται να επηρεάζεται η μορφολογία των κυτταρικών στοιχείων του αίματος. Προκύπτει επίσης ότι η σύζευξη μεταξύ ΜΝΓ και ΕΚ είναι ευκολότερο να καταγραφεί όταν το μέσο διασποράς είναι ο φυσιολογικός ορός και όχι το πλάσμα. Τα ΛΚ και τα ΑΠ καταστρέφονται από την παρουσία του φυσιολογικού ορού και δεν μπορούν να παρουσιαστούν δεδομένα για τη μορφολογία των ΛΚ και των ΑΠ μετά την ωρίμανση σε φυσιολογικό ορό. Θα πρέπει να τονιστεί ότι τα συμπεράσματα που προκύπτουν είναι εισαγωγικά και αφορούν μόνο στους συγκεκριμένους δότες. Εντούτοις, τα συμπεράσματα για τους 5 δότες είναι παρόμοια. Μια μικρή απόκλιση παρουσιάζει ένας ασθενής δότης, τα ΛΚ του οποίο επιβίωσαν σε ένα μικρό ποσοστό σε φυσιολογικό ορό, σε αντίθεση με τους υπόλοιπους δότες όπου υπήρξε καταστροφή του πληθυσμού των ΛΚ και ΑΠ από το φυσιολογικό ορό. Στα πλαίσια της παρούσης Μεταπτυχιακής Εργασίας, μελετήθηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις και μέσα διασποράς, σε κάθε περίπτωση όμως η θερμοκρασία της ΜΝΓ ήταν χαμηλότερη από την κρίσιμη ~37ο C. Παρά τα προκαταρκτικά ενθαρρυντικά συμπεράσματα και προκειμένου να εξαχθούν γενικευμένα συμπεράσματα θα πρέπει να αυξηθεί το δείγμα των δοτών, να εξεταστούν οι τιμές της συγκέντρωσης και του χρόνου ωρίμανσης σε μεγαλύτερο εύρος. Μια άλλη κρίσιμη παράμετρος που χρειάζεται να μελετηθεί, είναι η επίδραση της θερμοκρασίας και συγκεκριμένα όταν αυτή είναι μεγαλύτερη από την κρίσιμη θερμοκρασία μετάβασης της ΜΝΓ, οπότε και τα σωματίδια της ΜΝΓ συρρικνώνονται. Τέλος, θα πρέπει να μελετηθούν ηπιότερες μέθοδοι αντικατάστασης του πλάσματος από το φυσιολογικό ορό, προκειμένου να αποφευχθεί η καταστροφή των ΛΚ και των ΑΠ. Πιο συγκεκριμένα, αντί για απευθείας αντικατάσταση ολόκληρης της ποσότητας πλάσματος από φυσιολογικό ορό, θα μπορούσε να εξεταστεί η τμηματική αντικατάσταση του πλάσματος από το φυσιολογικό ορό κατά τη διαδικασία της ωρίμανσης (για παράδειγμα σε 5 στάδια), ώστε οι βιοχημικές μεταβολές οι οποίες θα είναι ευκολότερα ανεκτές από τα ΛΚ και τα ΑΠ. Θα μπορούσε επίσης να εξεταστεί η υποκατάσταση του πλάσματος από κάποιο άλλο μέσο και όχι από φυσιολογικό ορό.

During the last years, metallic nanoparticles (NPs) and some of their oxides, especially iron oxides (Fe2O3 and Fe3O4), are used in Medicine for diagnostic and therapeutic purposes. Iron oxide NPs are widely used because they can be produced in several shapes (like spheres, rods and cubes), their surface properties can be easily functionalized to avoid interactions among them, they are normally superparamagnetic and, finally, they are biocompatible. Their biocompatibility and their increased surface/volume ratio, make them attractive to be used for in vivo applications, like Magnetic Resonance Imaging, Targeted Drug Delivery and Hyperthermia. Despite the significant advantages, there is one major disadvantage that is their limited immunocompatibility, a term used to describe the compatibility with the immune system. Specifically, the term immunocompatibility is used to describe the reaction of the human body when the NPs are being recognized after some period while in circulation in the cardiovascular system. The so-called immunoresponse and the maximum period of NPs circulation depend on the physical properties of the NPs. In order to make the NPs immunocompatible and increase the circulation time in the cardiovascular system, some new types of NPs have been recently developed. These nano-scaled systems are consisted of biocompatible cross-linked polymers (nanogels) that behave as carriers where the NPs or drug can. These nanogels are based on poly (N-vinylcaprolactam) (PVCL) and poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM), while recently some carriers have been developed that are based on poly (N, N′-diethyl aminoethyl methacrylate) (PDEAEMA). These polymers are stimuli responsive to several parameters such as temperature and pH and they collapse (that is shrink) when the temperature or pH exceeds a critical value, while they release their content. Typical critical values are around 40ο C for the temperature and around 7 for the pH, respectively. These values fit nicely the range of human body conditions, thus these agents are promising candidates for in vivo applications. The objective of this MSc Thesis is the investigation of the biocompatibility of a magnetic nanogel (MNG) which consists of cross-linked polymer PDEAEMA (nanogel) and iron oxide magnetic NPs (Fe2O3 or Fe3O4) with the blood cells. The study is based on the observation of the cells’ deteriorations, using advanced imaging techniques, specifically the Atomic Force Microscopy (AFM) and the Scanning Electron Microscopy (SEM). Optical Microscopy (OM) is used at less extent, during sample preparation to confirm their suitability for the investigation with the AFM and SEM. For the completion of this study, samples of peripheral blood from 3 healthy and 2 patient donors were used. During the in vitro experiments a number of several parameters were studied. Specifically, the peripheral blood samples were maturated with the MNG for (a) different durations, (b) different concentrations and (c) different mediums. After the maturation procedure, single-layered films of the samples were prepared for observation with the advanced AFM and SEM imaging techniques that can achieve magnifications up to x1.000.000. These high magnifications are necessary, to accurately observe (a) possible changes in the cells’ shape as well as possible deteriorations on the cells’ membrane (that is expected to take place at early stages) and (b) possible conjugation between the cells and the MNG. Apart from these indices, this study was focused on the possible (a) lysis of the Red Blood Cells (RBCs), (b) phagocytosis of the MNG from the White Blood Cells (WBCs) and (c) aggregation of Platelets (Plts), using also them as biocompatibility indices. The results are categorized according to the cells type. RBCs are the most important cell line, because they constitute the majority population, thus they have increased possibility for interaction with the MNG. Our results show that the RBCs are not affected by the MNG whether the maturation procedure in performed in blood plasma or physiological saline. Most important, it has been observed that there is conjugation between RBCs and MNG that predominantly are attached at the periphery of RBCs. The conjugation is pronounced when the maturation is performed in physiological saline. Once we have ‘magnetically-modified RBCs’ at hand, we can accurately drive them by means of a magnetic field to the target tissue. Then the MNG can be used either as diagnostic contrast (Magnetic Resonance Imaging) or for selective release of a drug (Drug Delivery). The WBCs are the cells that are initially activated in order to remove the pathogens through the phagocytosis process. The introductory results of this MSc Thesis showed that the WBCs do not interact with the MNG, when the maturation process is completed in blood plasma. On the other hand, when we tried to accomplish the maturation process in physiological saline we observed that the WBCs were completely destroyed by the biochemical shock (osmotic processes that drive lysis of cells). These results are encouraging because it means that the MNG can achieve increased circulation time into the cardiovascular without being recognized by the immune system and it also does not affect the WBCs when the maturation process is completed in blood plasma. Plts, despite their small percentage in the blood, only 1%, have a very useful role, because of their coagulation properties that define the so-called hemostasis. Under certain conditions, this process is welcome, e.g. for wound healing. However, the possible interference of the MNG with coagulation processes needs to be investigated, in order to exclude the possibility of motivation and/or promotion of undesired blood clots. The results of this study showed that the Plts do not interact with the MNG when the maturation process is completed in blood plasma, as we do not observe any changes in their shape or in the coagulation properties. However, we observed that the Plts are also destroyed during their maturation in physiological saline. The overall conclusion of these in vitro experimental results is that the MNG is biocompatible for the specific conditions used during this study; the MNG does not affect the morphological and geometrical characteristics of blood cells. It is also concluded that the conjugation between the MNG and the RBCs advances more easily when physiological saline is used as the medium for the maturation procedure (in comparison to blood plasma). The WBCs and the Plts are destroyed by the physiological saline, so there is no data to present about the shape of the WBCs and the Plts, after their maturation with the MNG in physiological saline. It should be emphasized that these preliminary results refer to only the specific donors. Notably, the results for all 5 donors are similar. The only exception is for one patient, whose WBCs were not completely destroyed after the maturation with the MNG in physiological saline. During this MSc Thesis, different concentrations and mediums were investigated. In each case the temperature of the MNG was below 37ο C, which is the critical temperature for the specific nanogel. Despite the encouraging results, we need to increase the number of the donors, investigate a wider range of concentrations and maturation duration with the MNG. Another crucial parameter that needs to be investigated is the effect of the maturation temperature of the MNG with blood cells especially when it exceeds the critical temperature where the MNG collapse (that is shrink). Finally, more mild plasma-replacement procedures need to be found to avoid the destruction of WBCs and Plts during their processing with physiological saline. For instance, instead of a single plasma-saline replacement round, successive rounds (e.g. 5 rounds) can be employed during which the partial replacement of blood plasma with physiological saline is expected to result in biochemical processes that will be more easily tolerated from both WBCs and Plts. Alternatively, different plasma-replacement mediums could be investigated, as well.