MtMan26a: Η έκφραση μιας GH26 μαννανάσης από τον Myceliophthora thermophila και ο ρόλος της στην αποδόμηση της λιγνινοκυτταρινούχας βιομάζας

Πετρόπουλος, Περικλής; Petropoulos, Periklis

dc.contributor.author	Πετρόπουλος, Περικλής	el
dc.contributor.author	Petropoulos, Periklis	en
dc.date.accessioned	2015-06-11T08:12:01Z
dc.date.available	2015-06-11T08:12:01Z
dc.date.issued	2015-06-11
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/40811
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.11033
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού - Μη Εμπορική Χρήση - Παρόμοια Διανομή 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/gr/	*
dc.subject	Ετερόλογη έκφραση	el
dc.subject	Μαννανάση	el
dc.subject	Λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα	el
dc.subject	Pichia pastoris	el
dc.subject	Myceliophthora thermophila	el
dc.subject	Heterologous expression	en
dc.subject	Mannanase	en
dc.subject	Lignocellulosic biomass	en
dc.subject	Pichia pastoris	en
dc.subject	Myceliophthora thermophila	en
dc.title	MtMan26a: Η έκφραση μιας GH26 μαννανάσης από τον Myceliophthora thermophila και ο ρόλος της στην αποδόμηση της λιγνινοκυτταρινούχας βιομάζας	el
dc.title	MtMan26a: Heterologous expression of a GH26 mannanase from Myceliophthora thermophila and its role in the degradation of lignocellulosic biomass"	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2015-03-16
heal.abstract	Στην παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση και απομόνωση μιας μαννανάσης του ασκομύκητα Myceliophtora thermophila (NCBI Gene ID: 11508627), ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της και η συνεργιστική της δράση με εμπορικά κυτταρινολυτικά ένζυμα σε προκατεργασμένο φυσικό υπόστρωμα Lignocel. Η έκφραση πραγματοποιήθηκε με συνθετικό, codon-optimized, γονίδιο, το οποίο προσαρτήθηκε σε πλασμίδιο pPICZαC, αυξήθηκε και μετασχηματίστηκε σε ζύμη Pichia pastoris (στέλεχος Χ33). Ακολούθησε καλλιέργεια των μετασχηματισμένων στελεχών για παραγωγή μεγαλύτερης ποσότητας της μαννανάσης. Η μαννανάση απομονώθηκε από την καλλιέργεια με χρήση στήλης συγγένειας ιόντων κοβαλτίου. Η αποτελεσματικότητα του καθαρισμού ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) όπου επιβεβαιώθηκε η παρουσία μόνο της επιθυμητής πρωτεΐνης και το μοριακό βάρος της παραγόμενης πρωτεΐνης προσδιορίστηκε στα 60 kDa. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη της δράσης της μαννανάσης πάνω σε υπόστρωμα γαλακτομαννάνης χαρουπιού (συγκέντρωσης 0.5%) σε διαφορετικές συνθήκες pH και θερμοκρασίας, καθώς και η σταθερότητα της σε περιβάλλοντα διαφορετικών pH και θερμοκρασιών. Αποδείχθηκε ότι η μέγιστη δραστικότητα της εμφανίζεται σε pH 6 και θερμοκρασία 60 °C, ενώ είναι αρκετά σταθερή σε ένα εύρος pH 4-11 (βέλτιστη σταθερότητα pH 8). Επίσης, παρουσιάζει μεγάλη θερμοκρασιακή σταθερότητα (>95% στις 24 h) για θερμοκρασίες κάτω των 40 °C, αρκετά καλή θερμοκρασιακή σταθερότητα σε θερμοκρασία 50 °C (>85% στις 24h). Η ενεργότητα του ενζύμου μειώνεται σημαντικά για θερμοκρασίες άνω των 60 °C (χρόνος ημιζωής 5 h στους 60 °C, 1 h στους 65 °C). Εξετάστηκε η κινητική της ενζυμικής δράσης σε εύρος συγκεντρώσεων του υποστρώματος. Ακόμη, ερευνήθηκε η δράση του ενζύμου σε διαφορετικά υποστρώματα που απαντώνται στην λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα με το ένζυμο να εμφανίζει ισάξια ενεργότητα σε υπόστρωμα γλυκομαννάνης, ενώ δεν παρατηρήθηκε ενεργότητα σε υποστρώματα β-γλουκάνης και ξυλάνης σημύδας. Η δέσμευση του ενζύμου από κρυσταλλική κυτταρίνη μετρήθηκε και ανευρέθηκε ότι είναι μηδαμινή. Η μελέτη της συνεργιστικής δράσης του ενζύμου μαζί με εμπορικά κυτταρινολυτικά ένζυμα έδειξε βελτίωση (~10%) στην απελευθέρωση σακχάρων από υπόστρωμα προκατεργασμένου Lignocel.	el
heal.abstract	The present diploma thesis is concerned with the expression and purification of a mannanase from the ascomycota Myceliophtora thermophila (NCBI Gene ID: 11508627), its biochemical characterization and synergistic action with commercial cellulolytic enzymes on a natural substrate of pretreated Lignocel. The expression was performed from a synthetic codon-optimized gene, inserted in a pPICZαC vector, multiplied and transformed in the yeast Pichia pastoris (X33 strain). The yeast was then cultivated for production of sufficient quantities of the target mannanase. The enzyme was purified using a cobalt metal affinity chromatography column. The result of the purification was evaluated using polyacrylamide gel electrophoresis where it was confirmed that only the desirable enzyme was present in the solution, with a molecular weight of 60kDa. The activity of the mannanase was measured in a substrate of carob galactomannan (0.5% concentration) under different conditions of pH and temperature, as well as its long-term stability in environments with said conditions. The optimal conditions for enzyme activity were found to be at pH 6 and a temperature of 60 °C. The enzyme is very stable in a pH range from pH 4 to 11, with its stability quickly decreasing outside this range. Furthermore, it appeared to be thermally stable at temperatures lower than 40 °C (retaining more than 95% of maximum activity over 24 h) and fairly stable at a temperature of 50 °C (>85% of maximum activity over 24 h). The enzyme stability is drastically reduced for temperature over 60 °C (half-life of 5h at 60 °C, 1h at 65 °C). The enzyme kinetic behavior was examined over a range of substrate concentrations. The activity of the enzyme in several different substrates was measured and found to have equivalent activity on glucomannan substrate as in galactomannan. No activity was observed for other substrates such as b-glucan and birch Xylan. The enzyme found to lack any binding ability towards crystalline cellulose (Avicell). The synergistic testing on a pretreated Lignocel substrate with commercially available cellulolytic enzymes resulted in an increase (~10%) in released sugars.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Κολίσης, Φραγκίσκος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	78 σ.
heal.fullTextAvailability	true