Βελτιστοποίηση και θερμοδυναμική μελέτη ενζυμικής σύνθεσης εστέρων της τυροσόλης σε υδατικό σύστημα

Νόρρα, Φλοριάν; Norra, Florian

dc.contributor.author	Νόρρα, Φλοριάν	el
dc.contributor.author	Norra, Florian	en
dc.date.accessioned	2015-12-09T12:12:11Z
dc.date.available	2015-12-09T12:12:11Z
dc.date.issued	2015-12-09
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/41766
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.10932
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/gr/	*
dc.subject	Ενζυμική σύνθεση	el
dc.subject	Κουτινάση	el
dc.subject	Τυροσόλη	el
dc.subject	Υδατικό σύστημα	el
dc.subject	Θερμοδυναμική μελέτη	el
dc.subject	Enzymatic synthesis	en
dc.subject	Cutinase	el
dc.subject	Tyrosol	el
dc.subject	Aqueous system	el
dc.subject	Thermodynamic study	el
dc.subject	Βιοτεχνολογία	en
dc.title	Βελτιστοποίηση και θερμοδυναμική μελέτη ενζυμικής σύνθεσης εστέρων της τυροσόλης σε υδατικό σύστημα	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Χημική μηχανική	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2015-07-03
heal.abstract	Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η μελέτη της ενζυμικής μετεστερο-ποίησης της τυροσόλης με διάφορους βινυλεστέρες λιπαρών οξέων διαφορετικών μηκών ανθρακικής αλυσίδας σε υδατικό σύστημα κορεσμένο στον ακυλοδότη. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση της σύνθεσης του βουτυρικού εστέρα της τυροσόλης και μελέτη της κινητικής της. Επίσης, για την κατανόηση του συστήματος της αντίδρασης, πραγματοποιήθηκαν θερμοδυναμικές μελέτες. Αρχικά, κουτινάση από τον μικροοργανισμό Fusarium oxysporum (FoCut5a) παράχθηκε ετερόλογα σε επιδεκτικά στελέχη E.coli BL21 (DE3). Ο πλασμιδιακός φορέας που χρησι-μοποιήθηκε ήταν ο pET22b(+) ενώ το θρεπτικό υλικό ήταν το LB. Η επαγωγή της έκφρα-σης πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη IPTG (0.1 mΜ) και η επώαση πραγματοποιήθη-κε στους 16οC για 20 h. Ο καθαρισμός της παραχθείσας πρωτεΐνης έγινε σε στήλη βαρύ-τητας IMAC με ρητίνη ακινητοποιημένων ιόντων κοβαλτίου Talon® Metal Affinity Resin. Το μοριακό βάρος της προσδιορίστηκε στα 23 kDa ενώ το ισοηλεκτρικό της σημείο στα 7.9. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μελέτη της εκλεκτικότητας του ενζύμου με τη χρήση διαφορετικών βινυλεστέρων ως ακυλοδότες, του οξικού, προπιονικού, βουτυρικού, δεκα-νοϊκού, λαυρικού που διέφεραν στο μήκος της ανθρακικής τους αλυσίδας. Οι μεγαλύτε-ρες αποδόσεις προέκυψαν για το βουτυρικό και τον προπιονικό βινυλεστέρα (40 και 43% αντίστοιχα) με τον οξικό (30%) να ακολουθεί. Οι αποδόσεις για το δεκανοϊκό και το λαυ-ρικό βινυλεστέρα ήταν πολύ μικρές (της τάξης του 1%) Για τη βελτιστοποίηση της αντίδρασης μετεστεροποίησης της τυροσόλης με τον βουτυρι-κό βινυλεστέρα, εξετάστηκαν το pH, η θερμοκρασία, η συγκέντρωση του ενζύμου και η συγκέντρωση της τυροσόλης. Το βέλτιστο pH ήταν 7, η βέλτιστη θερμοκρασία 20 oC, βέλ-τιστη συγκέντρωση ενζύμου τα 5 μg/mL και βέλτιστη συγκέντρωση τυροσόλης 12.5 mM. Η αντίδραση βρέθηκε να ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten με Km=119.2 mM, kcat=134.6 s-1 και kcat/Km=1129.2 M-1•s-1. Για τις βέλτιστες συνθήκες, η απόδοση ήταν της τάξης του 50%. Η ταυτοποίηση του προϊόντος έγινε με NMR, αφού έγινε παραγωγή του σε μεγάλη κλίμακα και απομονώθηκε με χρωματογραφία προσρόφησης με χρήση silica gel. Η θερμοδυναμική μελέτη έγινε με τη χρήση των μοντέλων UNIFAC και COSMO-RS. Για τους πέντε βινυλεστέρες, υπολογίστηκε η διαλυτότητά τους στο νερό καθώς και η διαλυ-τότητα του νερού σε αυτούς με χρήση του COSMO-RS. Επίσης, για κάθε σύστημα αντί-δρασης, υπολογίστηκαν οι διαλυτότητες των εστέρων της τυροσόλης στο νερό και στους βινυλεστέρες. Τέλος, έγινε και υπολογισμός της κατανομής των προϊόντων κάθε συστή-ματος αντίδρασης στις δύο φάσεις τόσο με το COSMO-RS όσο και με τη UNIFAC. Τα απο-τελέσματα έδειξαν ότι η διαλυτότητα των εστέρων της τυροσόλης είναι πολύ μεγαλύτερη στην οργανική φάση από αυτήν στην υδατική και ότι το μεγαλύτερο μέρος του προϊόντος που παράγεται στην αντίδραση κατανέμεται στην οργανική φάση. Τα παραπάνω αποτε-λέσματα μας οδηγούν στον συμπέρασμα ότι πιθανότητα η αντίδραση πραγματοποιείται στην υδατική φάση (ή στην διεπιφάνεια) που έχει πρόσβαση το ένζυμο και το προϊόν με-τά την παραγωγή του μεταφέρεται στην οργανική φάση όπου και «προστατεύεται» από την υδρόλυση. Αυτή η ερμηνεία μπορεί να δικαιολογήσει και τις πολύ μικρές αποδόσεις των δύο εστέρων μεγάλων ανθρακικής αλυσίδας, καθώς δεν έχουν πρόσβαση στο νερό, λόγω αμελητέας διαλυτότητας σε αυτό. Αυτή είναι η πρώτη φορά που αναφέρεται ενζυμική σύνθεση του βουτυρικού εστέρα της τυροσόλης ενώ δεν έχει επίσης αναφερθεί στο παρελθόν κουτινάση σε ελεύθερη μορφή να καταλύει αντίδραση «αντίστροφης υδρόλυσης» σε υδατικό σύστημα κορεσμένο στον ακυλοδότη.	el
heal.abstract	The purpose of the present diploma thesis is the study of the enzymatic transesterification of tyrosol with different fatty acid vinyl esters of various carbon-chain lengths in an aqueous phase, saturated with the acyl donor. The synthesis of tyrosyl butyrate was opti-mized in addition to performing the kinetic study. To further understand the reaction sys-tem, thermodynamic calculations were also performed. Initially, cutinase from Fusarium oxysporum (FoCut5a) was heterologously expressed in competent E.coli BL21 (DE3) cells. The plasmid vector utilized for the expression was pET22b (+) and the culture medium chosen was LB. The expression was induced with IPTG (0.1 mM) and the culture was incubated at 16 οC for 20 h. The expressed protein was puri-fied in an IMAC gravity column with immobilized cobalt ion resin (Talon® Metal Affinity Resin). The molecular weight was calculated equal to 23 kDa and the isoelectric point equal to 7.9. Moreover, the enzyme specificity was studied against various vinyl esters different in car-bon-chain length as acyl donors. Specifically, vinyl acetate, propionate, butyrate, deca-noate and laurate were used. The greatest yields were found to be in the cases of vinyl bu-tyrate and propionate (40 and 43% respectively) followed by vinyl acetate (30%). The yields for vinyl decanoate and laurate were particularly low (~1%). The specificity study was followed by the optimization of the transesterification reaction of tyrosol with vinyl butyrate. The reaction was optimized with respect to pH, temperature, enzyme loading and tyrosol concentration. The optimal pH was found to be 7, the optimal temperature 20 oC, the optimal enzyme concentration 5 μg/ml and the optimal tyrosol concentration 12.5 mM. The reaction was revealed to follow MIchaelis-Menten kinetics with the following constants Km=119.2 mM, kcat=134.6 s-1 και kcat/Km=1129.2 M-1•s-1. For optimal reaction conditions the yield reached was approximately 50%. The product was characterized via NMR, after scaled-up production and purification through absorption chromatography using silica gel as the stationary phase. The thermodynamic study was performed using the computational models UNIFAC and COSMO-RS. Water solubility was calculated for all five vinyl esters with the COSMO-RS model, as well as water’s solubility in those vinyl esters. Furthermore, solubility of the ty-rosyl esters was calculated for both phases in each reaction system. Finally, the product distribution between phases was calculated utilizing the UNIFAC and COSMO-RS models in each reaction system. The results indicated that the solubility of tyrosyl esters is much greater in the organic than the aqueous phase and the majority of the product is distri-buted in the organic phase. These results indicate that the reaction takes place probably in the aqueous phase (or the water-oil interface) where the enzyme has access and subse-quently the product is retained in the organic phase, where it is protected from further hydrolysis. This explanation can justify the minimal yields of the two long-chain esters uti-lized, as they do not seem have access to the aqueous phase, due to their low solubility. This is the first reported attempt in enzymatic synthesis of tyrosyl butyrate. Also there are no references regarding the use of free-form cutinase for the catalysis of a reverse hydro-lysis reaction in an aqueous system saturated with the acyl donor.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Βουτσάς, Επαμεινώνδας	el
heal.committeeMemberName	Κολίσης, Φραγκίσκος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	113 σ.
heal.fullTextAvailability	true