Μοριακή, δομική και καταλυτική μελέτη καινοτόμων βιοκαταλυτών (ημικυτταρινάσες) που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας

Χαραυγή, Μαρία-Δέσποινα; Charavgi, Maria-Despoina

dc.contributor.author	Χαραυγή, Μαρία-Δέσποινα	el
dc.contributor.author	Charavgi, Maria-Despoina	en
dc.date.accessioned	2016-01-13T07:07:55Z
dc.date.available	2016-01-13T07:07:55Z
dc.date.issued	2016-01-13
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/41834
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.1870
dc.rights	Default License
dc.subject	Ημικυτταρίνη	el
dc.subject	Εστεράση του γλυκουρονικού οξέος	el
dc.subject	Βιοκατάλυση	el
dc.subject	Αποικοδόμηση φυτικής βιομάζας	el
dc.subject	Τρισδιάστατες δομές	el
dc.subject	Hemicellulose	en
dc.subject	Glucuronoyl Esterase	el
dc.subject	Biocatalysis	el
dc.subject	Plant biomass degradation	el
dc.subject	3D structures	el
dc.title	Μοριακή, δομική και καταλυτική μελέτη καινοτόμων βιοκαταλυτών (ημικυτταρινάσες) που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας	el
dc.title	Molecular, structural and catalytic study of novel biocatalysts (hemicellulases) involved in the degradation of plant biomass	en
dc.contributor.department	Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.type	doctoralThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Δομική Βιολογία	el
heal.classification	Κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.classification	Structural Biology	en
heal.classification	X-Ray Crystallography	en
heal.classificationURI	http://id.loc.gov/authorities/subjects/sh00007765
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2015-09-28
heal.abstract	Η αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας με τη χρήση ημικυτταρινασών παραμένει ένα από τα προαπαιτούμενα για την αποδοτική παραγωγή βιοκαυσίμων από ζυμώσιμα σάκχαρα, ενώ σύμφωνα με οδηγία της Ευρωπαϊκής Ένωσης το 10% των συμβατικών καυσίμων θα πρέπει να έχει αντικατασταθεί με βιοκαύσιμα μέχρι το 2020. Προς αυτήν την κατεύθυνση, τα θερμοσταθερά ένζυμα που εμπλέκονται στη βιοκατάλυση λιγνινοκυτταρινούχων πρώτων υλών, αποτελούν ένα πολλά υποσχόμενο ερευνητικό πεδίο λόγω της πληθώρας των βιοτεχνολογικών εφαρμογών τους ακόμα και κάτω από έντονες συνθήκες βιομετατροπών βιομηχανικής κλίμακας αλλά και του μειωμένου οικονομικού κόστους. Οι γλυκουρονικές εστεράσες (Glucuronoyl Esterases, GEs), ανήκουν σε μια πρόσφατα ανακαλυφθείσα οικογένεια υδατανθρακικών εστερασών (Carbohydrate Esterases, CEs), την οικογένεια CE-15 (CAZy database), των οποίων η δράση διαφαίνεται να εντοπίζεται στην υδρόλυση του εστερικού δεσμού μεταξύ των πλευρικών ομάδων του 4-O-μεθυλο-D-γλυκουρονικού οξέος της γλυκουρονοξυλάνης και αρωματικών αλκοολών της λιγνίνης. Ο συγκεκριμένος δεσμός θεωρείται ότι εκπροσωπεί ένα από τα δυσκολότερα στάδια που απαντώνται κατά την πλήρη αποδέσμευση της λιγνίνης από τους υδατάνθρακες που συνθέτουν την ημικυτταρίνη. Kαθώς ο φυσιολογικός ρόλος και μηχανισμός δράσης των GEs δεν είναι πλήρως γνωστός, στην παρούσα διδακτορική διατριβή δόθηκε έμφαση στην εστεράση του γλυκουρονικού οξέος αλλά και μεταλλάγματός της από το θερμόφιλο μύκητα Myceliophthora thermophila (συνώνυμο Sporotrichum thermophile, StGE2 και S213A StGE2, αντίστοιχα), και στην εστεράση του γλυκουρονικού οξέος από το μεσόφιλο μικροοργανισμό Podospora anserina (PaGE1). Πιο αναλυτικά, στην παρούσα ερευνητική εργασία πραγματοποιήθηκαν μελέτες τόσο της StGE2 όσο και της PaGE1 ως προς την υδρόλυση εμπορικά διαθέσιμου συνθετικού υποστρώματος. Στόχο αποτέλεσε η δημιουργία ενός καινοτόμου και εύχρηστου πρωτοκόλλου μελέτης του ενζύμου που προάγει την αποσαφήνιση της δράσης αυτού αλλά και περισσοτέρων ενζύμων της ιδίας οικογενείας των GEs. Πέραν της μεγάλης βιοτεχνολογικής της εφαρμογής, η πειραματική μεθοδολογία τριών σταδίων που αναπτύχθηκε αποτελεί έναυσμα για την ανακάλυψη και περαιτέρω μελέτη νέων GEs μέσω εκτενούς σάρωσης της ετερόλογης έκφρασης Γενομικών και Μεταγενομικών βιβλιοθηκών. Παράλληλα, εξετάστηκε η StGE2 ως προς το συνθετικό δυναμικό μέσω αντιδράσεων εστεροποίησης και μετεστεροποίησης σε μη συμβατικά συστήματα. Η αξιολόγηση της συνθετικής ενεργότητας του ενζύμου περιελάμβανε επίσης την ακινητοποίησή του μέσω παρασκευής ενζυμικών συσσωματωμάτων διασταυρούμενων δεσμών (CLEAs). Στην ελεύθερη μορφή του το ένζυμο εμφάνισε ενδείξεις βιοκαταλυτικής σύνθεσης γλυκουρονικών εστέρων στις συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν. Επιπροσθέτως, διερευνήθηκε η φυσιολογική δράση του ενζύμου μέσω δοκιμών απομόνωσης λιγνινο-υδατανθρακικών συμπλόκων (Lignin-Carbohydrate Complexes, LCCs) ως φυσικών υποστρωμάτων δυνάμει εμπλουτισμένα σε εστερικούς δεσμούς-στόχο για τις GEs. Η ανάλυση των προϊόντων απομόνωσης αλλά και των προϊόντων μετά από υδρόλυση παρουσία τόσο της StGE2 όσο και άλλων ημικυτταρινασών, έγινε με φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (Fourier Transform InfraRed spectroscopy, FT-IR). Η καταλυτική ενεργότητα της StGE2 αλλά και άλλων ημικυτταρινασών έναντι του αρχικού δείγματος ελάτης αλλά και των LCCs, αποτελεί ένα βήμα προς τη διαλεύκανση του φυσικού ρόλου των GEs. Τέλος, μεγάλο μέρος της παρούσας ερευνητικής εργασίας αποτέλεσαν οι κρυσταλλογραφικές μελέτες ακτίνων Χ με πρωτεϊνικούς στόχους τόσο την StGE2 όσο και τη σημειακά μεταλλαγμένη S213A StGE2, η οποία αποτελεί την καταλυτικά ανενεργή μορφή του ενζύμου ως προς την υδρόλυση του μεθυλεστέρα του 4-O-μεθυλο-D-γλυκουρονικού οξέος (MeGlcA). Μετά την επιτυχή κρυστάλλωση των υπό εξέταση πρωτεϊνών, συλλέχθηκαν δεδομένα περίθλασης ακτίνων Χ που οδήγησαν στην επίλυση και βελτιστοποίηση των τρισδιάστατων δομών τους σε υψηλή ευκρίνεια 1.55 Å και 1.9 Å, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, έλαβαν χώρα δομικές μελέτες πρόσδεσης συνθετικών υποστρωμάτων και κατέστη επιτυχής ο προσδιορισμός της τρισδιάστατης κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου S213A – MeGlcA σε ευκρίνεια 2.35 Å. Οι συγκεκριμένες δομές αποτελούν τις πρώτες δομές θερμοάντοχης GE της CE-15 οικογενείας, που φέρει σημειακή μετάλλαξη σε καταλυτικό αμινοξύ ενώ αυτή του συμπλόκου S213A - MeGlcA αποτέλεσε την πρώτη δομή GE ως συμπλόκου με κάποιο ανάλογο υποστρώματος. Οι κινητικές μελέτες, το πιθανό συνθετικό δυναμικό του ενζύμου καθώς και η υδρολυτική του δράση έναντι απομονωμένου φυσικού υποστρώματος, σκιαγραφούν έναν ελκυστικό ερευνητικό στόχο, ενώ οι πρωτεϊνικές δομές που προσδιορίστηκαν αποκάλυψαν για πρώτη φορά το «αποτύπωμα» της πρόσδεσης ενός υποστρώματος σε μια GE. Η μοριακή, δομική και καταλυτική μελέτη των GEs στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής διανοίγει νέες προοπτικές για τη βιοτεχνολογική αξιοποίηση αλλά και για τη βιομηχανική εκμετάλλευσή τους σε συνδυασμό με άλλα ένζυμα του ημικυτταρινολυτικού συμπλέγματος.	el
heal.abstract	Plant biomass degradation by hemicellulases remains one of the prerequisites for the efficient production of the so-called second generation biofuels from fermentable sugars, while according to the European Union Community framework, biofuels should replace a minimum of 10% of the conventional fuels by 2020. To this end, thermostable enzymes, implicated in lignocellulosic materials’ biocatalysis, are promising targets due to their wide range of biotechnological applications even under harsh industrial conditions during bioconversion but also in view of their low cost. Glucuronoyl Esterases, GEs, belong to a recently discovered family of Carbohydrate Esterases, the CE-15 family (CAZy database), and have been attributed the prevalent role of hydrolyzing the ester bonds between lignin alcohols and the 4-O-methyl-D-glucuronic acid side chains of glucoronoxylan. This specific bond is considered to be one of the main bottlenecks that impair the complete dissociation of lignin from the hemicellulosic carbohydrates. As the exact function and catalytic mechanism of GEs is yet to be fully delineated, the present thesis focuses on a glucuronoyl esterase and also its mutant from the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila (synonym Sporotrichum thermophile, StGE2 and S213A StGE2, respectively) and a glucuronoyl esterase from the mesophilic microorganism Podospora anserina (PaGE1). More specifically, the present work involved studies performed on the hydrolysis of a commercially available synthetic substrate by StGE2 and PaGE1. With the aim to highlight GEs’ mode of action, a novel and easy to apply protocol was developed. Besides its high biotechnological interest and broad applications, this three-level experimental procedure can also give rise to the discovery of different GEs via a wide/large-scale screening of heterologous Genomic and Metagenomic expression libraries. Furthermore, the potential of StGE2 to synthesize glucuronides was investigated through esterification and transesterification reactions in non conventional systems. To evaluate its synthetic activity, the enzyme was also immobilized as cross-linked enzyme aggregates (CLEAs). StGE2 exhibited some indications of biocatalytic ability to synthesize glucuronic esters when free under the conditions used in the study. With the aim to further examine the physiological role of GEs, isolation of lignin-carbohydrate complexes, LCCs followed. These hypothetically bulk compounds are suggested to constitute the “enriched in ester bonds-targets”, which are natural substrates of the enzyme. Fourier Transform InfraRed spectroscopy, FT-IR, was used for the analysis of the extracted products as well as the products after hydrolysis in the presence of not only StGE2 but also other hemicellulases. The catalytic activity of StGE2 and the hemicellulases studied against spruce as the raw material as well as the isolated LCCs, is a step towards the elucidation of the physiological function of GEs. Finally, the present thesis involved extensive X-ray protein crystallography studies using StGE2 and S213A StGE2 mutant as macromolecular targets, with the latter being the catalytically inactive form of the enzyme with reference to the hydrolysis of the methyl 4-O-methyl-D-glucopyranuronate (MeGlcA). Successful crystallization followed by X-Ray diffraction data collection, led to the three-dimensional structure determination of StGE2 and S213A at high resolution, 1.55 Å and 1.9 Å, respectively. Binding studies using synthetic substrate analogues were performed, and the crystal structure of the S213A mutant in complex with MeGlcA was determined at 2.35 Å resolution. These are the first crystal structures of a CE-15 family thermophilic GE and a catalytically inactive StGE2 mutant in complex with a substrate analogue. Overall, the results obtained from the kinetic studies, the possible synthetic ability as well as the catalytic activity of StGE2 against natural substrates, make it an attractive research target of biotechnological interest. In addition, its 3D structure uncovered for the first time the fingerprint of substrate binding to a GE. In the context of the present thesis, the molecular, structural and catalytic studies of GEs broadens the scope of utilizing this enzyme in biotechnological applications as well employing it in a plethora of industrial processes in conjunction with different enzymes pertaining to the hemicellulolytic system.	en
heal.sponsor	H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) – Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου.	el
heal.advisorName	Χριστακόπουλος, Παύλος	el
heal.committeeMemberName	Χριστακόπουλος, Παύλος	el
heal.committeeMemberName	Κυριακίδης, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Κολίσης, Φραγκίσκος	el
heal.committeeMemberName	Μπεθάνης, Κωνσταντίνος	el
heal.committeeMemberName	Χατζηνικολάου, Δημήτριος	el
heal.academicPublisher	Σχολή Χημικών Μηχανικών	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	233
heal.fullTextAvailability	true