Απομόνωση και βιοχημικός χαρακτηρισμός νέας θερμοσταθερής κυτταρινάσης από εμπλουτισμένο μεταγονιδιωματικό δείγμα Ισλανδικής θερμοπηγής

Κίσσας, Δημήτριος; Kissas, Dimitrios

dc.contributor.author	Κίσσας, Δημήτριος	el
dc.contributor.author	Kissas, Dimitrios	en
dc.date.accessioned	2016-02-26T11:40:35Z
dc.date.available	2016-02-26T11:40:35Z
dc.date.issued	2016-02-26
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/42059
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.10173
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Βιοχημικός χαρακτηρισμός	el
dc.subject	Ένζυμα	el
dc.subject	Απομόνωση	el
dc.subject	Κυτταρινάσες	el
dc.subject	Μεταγονιδιωματική	el
dc.subject	Θερμοσταθερότητα	el
dc.subject	Biochemical characterization	en
dc.subject	Enzymes	en
dc.subject	Thermostability	en
dc.subject	Cellulase	en
dc.subject	Isolation	en
dc.subject	Metagenomics	en
dc.subject	CelDZ1	en
dc.subject	celDZ1	el
dc.title	Απομόνωση και βιοχημικός χαρακτηρισμός νέας θερμοσταθερής κυτταρινάσης από εμπλουτισμένο μεταγονιδιωματικό δείγμα Ισλανδικής θερμοπηγής	el
dc.title	Isolation and biochemical characterization of a thermostable GH 5 cellulase from an Icelandic hot spring enrichment isolate	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2015-07-03
heal.abstract	Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο ευρύτερο πλαίσιο του Ευρωπαϊκού ερευνητικού προγράμματος HotZyme (EU/FP7/KBBE-2010.3.5-0) που είχε ως στόχο την ανακάλυψη νέων, θερμοανθεκτικών υδρολασών από θερμά περιβάλλοντα μέσω μεταγoνιδιωματικής ανάλυσης. Κατά τη διάρκεια της εργασίας έγινε απομόνωση και χαρακτηρισμός μια νέας θερμοσταθερής κυτταρινάσης με ενδιαφέρουσες ιδιότητες που την καθιστούν υποψήφιο ένζυμο για βιομηχανική χρήση. Στο πλαίσιο του προγράμματος πραγματοποιήθηκε βιοπληροφορική ανάλυση μεταγονιδιωματικού δείγματος εμπλουτισμένου σε πολυσακχαρίτες. Από τα δεδομένα αυτά, επιλέχθηκε ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης λόγω της σχετικής ομοιότητας (59%) με μια χαρακτηρισμένη ενδογλουκανάση του Bacillus Akibai [1]. Η αλληλουχία αυτή απομονώθηκε με PCR από το μεταγονιδιωματικό δείγμα DNA, εκφράστηκε σε E. coli και βρέθηκε ότι κωδικοποιεί μια GH5 ενδογλουκανάση η οποία και ονομάστηκε CelDZ1a. Με χρήση βιοπληροφορίκων εργαλείων προβλέφθηκε η ύπαρξη μιας διαμεμβρανικής έλικας στο Ν-τελικό άκρο της πρωτεΐνης η οποία και αφαιρέθηκε, δίνοντας την παραλλαγή της αρχικής πρωτεΐνης που αναφέρεται ως CelDZ1. Η αφαίρεση της διαμεμβρανικής έλικας διευκόλυνε τον καθαρισμό και αύξησε τα επίπεδα έκφρασης του ενζύμου, καθώς και την αντίσταση του σε πρωτεόλυση κατά τη διάρκεια παραγωγής του. Τέλος πραγματοποιήθηκε ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της CelDZ1 κατά τον οποίο προσδιορίστηκαν τα χαρακτηριστικά του νέου ενζύμου κάτω από ένα μεγάλο εύρος συνθηκών. Η κυτταρινάση CelDZ1 παρουσιάζει βέλτιστη θερμοκρασία λειτουργίας τους 70 oC με χρόνο ημιζωής περίπου 4.5 h στους 70 οC βαθμούς και βέλτιστη τιμή pH 5. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι το νέο ένζυμο παρουσιάζει εξαιρετική σταθερότητα παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων αλάτων, ακόμα και όταν αυτές προσεγγίζουν το σημείο κορεσμού. Επίσης, η δράση του ενισχύεται παρουσία ιόντων μαγγανίου και β-μερκαπτοαιθανόλης ενώ μειώνεται παρουσία ιόντων σιδήρου. Τέλος, ενδιαφέρων παρουσιάζει το γεγονός ότι η CelDZ1 επιδεικνύει εξαιρετική εκλεκτικότητα στην διάσπαση των β-1,4 γλυκοζιτικών δεσμών των διαλυτών υποστρωμάτων.	el
heal.abstract	This work was performed in the framework of the European research program HotZyme (EU/FP7/KBBE-2010.3.5-0) which was aiming at the discovery of new, thermostable hydrolases from hot environments through metagenomics screening. In the present thesis, the isolation and characterization of a new thermostable cellulase with interesting properties for industrial use is described. In the context of the aforementioned research program, metagenomics sample enriched in polysaccharides was sequenced and analyzed with bioinformatics tools. An open reading frame which exhibits moderate similarity (59%) to a characterized endoglucanase from Bacillus Akibai [1] and bears a predicted cellulase catalytic domain was selected for further analysis. The sequence was isolated with PCR from the metagenomic DNA sample, expressed in E. coli and was found to encode for a GH5 endoglucanase which was designated as CelDZ1a. Furthermore, a transmembrane helix in the N terminus of the protein was predicted and removed, allowing a variation of the original protein referred to as CelDZ1. Removal of the transmembrane helix facilitated the purification and increased the expression levels of the enzyme as long as the proteolysis resistance during production. Finally, the biochemical characterization of CelDZ1 was performed, during which the properties of the new enzyme under a wide range of conditions were determined. The cellulase CelDZ1 presents optimal operation temperature of 70 oC with a half-life of approximately 4.5 h at 70 oC and optimum pH 5. It is noteworthy that the new enzyme has remarkable stability in the presence of high salt concentrations, even near saturation levels. In addition, activity is enhanced in the presence of Mn2+ ions and beta-mercaptoethanol, while activity is reduced in the presence of Fe ions. Finally, it is interesting that CelDZ1 exhibits excellent selectivity against beta 1-4 glycosidic linkages of insoluble substrates.	en
heal.sponsor	European research program HotZyme (EU/FP7/KBBE-2010.3.5-0)	en
heal.advisorName	Κολίσης, Φραγκίσκος	el
heal.committeeMemberName	Κολίσης, Φραγκίσκος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	76 σ.
heal.fullTextAvailability	true