Φασματοσκοπική μελέτη της επίδρασης των ακτινοβολιών στον ανθρώπινο χόνδρο

Μαυρογένης, Ανδρέας; Mavrogenis, Andreas

dc.contributor.author	Μαυρογένης, Ανδρέας	el
dc.contributor.author	Mavrogenis, Andreas	en
dc.date.accessioned	2016-06-14T07:35:50Z
dc.date.issued	2016-06-14
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/42684
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.1867
dc.rights	Default License
dc.subject	Βιοφασματοσκοπία	el
dc.subject	Spectroscopy	en
dc.subject	Μετασχηματισμός Fourier	el
dc.subject	Αρθρικός χόνδρος	el
dc.subject	Ιοντίζουσες ακτινοβολίες	el
dc.subject	Πρωτεογλυκάνες	el
dc.subject	Fourier transform	en
dc.subject	Articular cartilage	en
dc.subject	Ionizing radiation	en
dc.subject	Proteoglycans	en
dc.title	Φασματοσκοπική μελέτη της επίδρασης των ακτινοβολιών στον ανθρώπινο χόνδρο	el
heal.type	doctoralThesis
heal.generalDescription	Η ακτινοθεραπεία με ιοντίζουσες ακτινοβολίες και η χημειοθεραπεία χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση των συστηματικών εκδηλώσεων και δευτεροπαθών εντοπίσεων του καρκίνου, καθώς και για τον τοπικό έλεγχο της νόσου προεγχειρητικά με σκοπό τη διευκόλυνση της χειρουργικής θεραπείας. Η αποτελεσματικότητα των θεραπειών αυτών αξιολογείται από την βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών με νεοπλάσματα. Ωστόσο, παρά το γεγονός ότι η ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία αποτελούν βασικές θεραπείες στη διεπιστημονική αντιμετώπιση των ασθενών με καρκίνο, σχετίζονται με ανεπιθύμητες ενέργειες και δυνητικά σοβαρές επιπλοκές (Cannon et al. 2006, Ozger et al. 2010). Η κλινική εμπειρία και οι αντίστοιχες εργασίες έχουν αναδείξει ότι κάθε όργανο και ιστός έχουν διαφορετική αντοχή και αντίδραση στις ιοντίζουσες ακτινοβολίες, έτσι ώστε ποικίλες επιπλοκές μπορεί να εκδηλωθούν στο ίδιο και σε παρακείμενα όργανα. Οι επιπλοκές αυτές εξαρτώνται από τη διανομή της ακτινοβολίας και την κλασματοποίηση της θεραπείας (Hopewell, 2000). Σε αντίθεση με τη χημειοθεραπεία, ελάχιστες προοπτικές μελέτες υπάρχουν διαθέσιμες για τον καθορισμό της μέγιστης δόσης της ακτινοβολίας και την αντοχή των ιστών σε αυτή, καθώς και για την αξιολόγηση μοντέλων υποκλασματοποίησης της ακτινοθεραπείας με σκοπό την αναγνώριση και πρόληψη των δυνητικών μετακτινικών επιλοκών (Stone et al. 2003, Borst et al. 2010, Hua et al. 2010, Rutkowska et al. 2010). Ο λόγος είναι ότι τέτοιες εργασίες είναι δύσκολο να διεξαχθούν λόγω των συνηθέστερα όψιμων επιπλοκών της ακτινοβολίας και του σχετικά μικρού προσδόκιμου ζωής των ασθενών με καρκίνο (Kong et al. 2007). Για το λόγο αυτό, συνήθως αξιολογούνται και χορηγούνται φυσικές δόσεις ακτινοβολίας και εμπειρικές θεραπείες αντοχής των ιστών κατά το σχεδιασμό και την κλασματοποίηση των διαφόρων σχημάτων ακτινοθεραπείας (Stone et al. 2003, Hua et al. 2010, Lin, 1996). Το ώριμο οστούν έχει αντοχή στις ιοντίζουσες ακτινοβολίες σε δόσεις της τάξης των 65 Gy έως 70 Gy (Ikushima et al. 2006). Τα περισσότερα σχήματα προεγχειρητικής ακτινοθεραπείας περιλαμβάνουν μικρότερη δόση ακτινοβολίας (περίπου 50 Gy) συγκριτικά με τα σχήματα μετεγχειρητικής ακτινοθεραπείας (66-70 Gy) στα οποία η δόση της ακτινοβολίας είναι μεγαλύτερη με σκοπό την «αποστείρωση» του χειρουργικού πεδίου από τα καρκινικά κύτταρα (O’Sullivan et al. 2002). Επιπλέον, το πεδίο μετεγχειρητικής ακτινοβολίας είναι μεγαλύτερο λόγω της έκτασης της χειρουργικής εκτομής και του μετεγχειρητικού αιματώματος (Nielson et al. 1991). Συνεπώς, η έκταση της ακτινικής βλάβης σε υγιείς ιστούς αναμένεται να είναι μεγαλύτερη σε ασθενείς οι οποίοι έλαβαν μετεγχειρητική συγκριτικά με εκείνους οι οποίοι έλαβαν προεγχειρητική ακτινοθεραπεία. Επιπλέον, ο συνδυασμός ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας έχει συνεργική δράση στον κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων, αλλά επιπλέον αυξάνει την ευαισθησία των υγιών ιστών στην ιοντίζουσα ακτινοβολία το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε περισσότερες μετακτινικές επιπλοκές (Cannon et al. 2006, Hua et al. 2010, Lee et al. 2010). Τα τελευταία περίπου 20 χρόνια, η φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (Fourier Transform Infrared, FT-IR), κλασσική και micro-FT-IR, χρησιμοποιούνται συστηματικά στην μελέτη των ανθρωπίνων ιστών, ενώ η μέθοδος τείνει να εφαρμοσθεί στην ανάδειξη και προδιάγνωση διαφόρων ασθενειών σε μοριακό επίπεδο (Mavrogenis et al. 2015, Anastassopoulou et al. 2007, 2009, 2011,2014, Conti et al. 2008, Mamarelis et al. 2011, 2011a, Dritsa et al. 2014). Η μέθοδος επιτρέπει την μελέτη βιοπολυμερών και σύνθετων βιολογικών συστημάτων, όπως τα οστά, ενώ η χρησιμοποιούμενη ποσότητα του βιολογικού υλικού ανέρχεται σε μερικά μg, μm ή μl χωρίς την απαίτηση ειδικής επεξεργασίας του δείγματος. Οι πληροφορίες λαμβάνονται από τις δονήσεις των χαρακτηριστικών λειτουργικών ομάδων, π.χ. ΝΗ2, C=O, -ΟΗ, ΡΟ2-, των πρωτεϊνών, λιπαρών οξέων, DNA, τους χημικούς δεσμούς και τη διαμόρφωση των μορίων (Theophanides 1978, 1984, 2012, 1015). Η FT-IR φασματοσκοπία καταγράφει τα φάσματα ταλαντώσεως τα οποία παράγονται από την αλληλεπίδραση της υπέρυθρης ακτινοβολίας με τα μόρια της ύλης, στις συχνότητες 4000-400 cm-1. Επειδή οι ιστοί είναι σύνθετα βιολογικά συστήματα απαιτείται ιδιαίτερη γνώση για την επιλογή της τεχνικής λήψης των υπέρυθρων φασμάτων των δειγμάτων. O συνδυασμός μικροσκοπίου (micro-FT-IR) και η τεχνική της Αποσβένουσας Ολικής Ανάκλασης (ATR, Attenuated Total Reflectance) επιτρέπουν την μελέτη της διεπιφάνειας των ιστών. Εμφανίζει το μοναδικό πλεονέκτημα να παρέχει συγχρόνως πληροφορίες για τη διαμόρφωση των μεμβρανών και λιπιδίων και τον προσανατολισμό των παράπλευρων αλυσίδων των βιολογικών μεγαλομορίων και πληροφορίες για το μικρο-περιβάλλον του κυττάρου (Dritsa et al. 2014, Mamarelis et al. 2011, Anastassopoulou et al. 2014). Ιδιαίτερα τονίζεται ότι στην περίπτωση των ιστών εμφανίζει το πλεονέκτημα να μελετά ταυτόχρονα το περιβάλλον των μεμβρανών (οργανική φάση) αλλά και των αλάτων (ανόργανη φάση ή οργανομεταλλική φάση), χωρίς να απαιτείται ιδιαίτερη επεξεργασία του δείγματος (Dritsa et al. 2014, Anastassopoulou et al. 2014). Για τη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκε η ATR-FT-IR και micro-FT-IR φασματοσκοπία δεδομένου ότι οι τεχνικές είναι ταχύτατες, δεν απαιτεί κατεργασία του δείγματος, ενώ απαιτείται ελάχιστη ποσότητα (μερικά μg) βιολογικού ιστού. Η αρχιτεκτονική της επιφάνειας των οστών μελετήθηκαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης SEM (Scanning Electron Microscopy) και οπτικό μικροσκόπιο υψηλής ανάλυσης, ενώ η ανάλυση εικόνας έγινε με υπολογιστικό πρόγραμμα ImageJ. Οι χρησιμοποιούμενες μέθοδοι είναι είναι μη καταστρεπτικές μέθοδοι και επομένως δεν προκαλούν βλάβες στα προς μελέτη δείγματα. Οι παρατηρούμενες επομένως μεταβολές μπορούν να αποδοθούν αποκλειστικά στην υποκείμενη επίδραση της ακτινοβολίας ή την νόσο των οστών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, προκειμένου να μελετηθούν οι βλάβες οι οποίες προκαλούνται από την επίδραση των ακτινοβολιών κατά την εφαρμογή της ακτινοθεραπείας, ακτινοβολήθηκαν in vitro οστά τα οποία δεν εμφάνιζαν καρκίνο ή άλλες μεταβολικές ασθένειες. Στόχος ήταν η προσέγγιση στο μηχανισμό των αντιδράσεων των ελευθέρων ριζών με τα βιολογικά συστατικά του κυττάρου των οστών. Τα φάσματα τα οποία ελήφθησαν συγκρίθηκαν με αντίστοιχα φάσματα οστών τα οποία εμφάνιζαν οστεοπόρωση ή καρκίνο, ώστε να διαπιστωθεί αν υπάρχουν κοινά παραγόμενα προϊόντα κατά την ανάπτυξη των ασθενειών με εκείνα που παράγονται από την ακτινοβόληση. Τα συμπεράσματα θα οδηγήσουν ενδεχομένως στην εφαρμογή νέων σχημάτων ακτινοθεραπείας για την προστασία των υγιών ιστών.	el
heal.classification	Ακτινοχημεία και Βιοφασματοσκοπία	el
heal.dateAvailable	2017-06-13T21:00:00Z
heal.language	el
heal.access	embargo
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2016-06-01
heal.abstract	Στην προύσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η υπέρυθρη φασματοσκοπία με μετασχηματισμό Fourier σε συνδυασμό με οπτικό μικροσκόπιο υψηλή ανάλυσης και μικροσκόπιο διασποράς SEM (scanning electron microscopy) για την in vitro μελέτη της επίδρασης των ιοντιζουσών ακτινοβολιών στον αρθρικό χόνδρο, τη διεπιφάνεια με το οστούν, και για την προσέγγιση του χημικού μηχανισμού που προκαλείται κατά την ακτινοθεραπεία. Από τις μεταβολές των εντάσεων και τις νέες ταινίες στην περιοχή μεταξύ 4000-2800 cm-1, διαπιστώθηκε ότι οι βλάβες οι οποίες προκαλούνται σε μικρές δόσεις ακτινοβολίας μέχρι 6 Gy είναι οι σχάσεις των δεσμών υδρογόνου των γλυκοζαμινογλυκανών (πολυγλυκάνες, υαλουρονικό οξύ) και των κολλαγονούχων πρωτεϊνών. Τα θραύσματα του κολλαγόνου και υαλουρονικού οξέος αντιδρούν μεταξύ τους με διασταυρούμενο πολυμερισμό σχηματίζοντας προϊόντα στα οποία αποδίδεται η μείωση του ιξώδους των χόνδρων και επομένως η αύξηση της τριβής και τέλος η φθορά των χόνδρων. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με σύγκριση ανάλογων χόνδρων οι οποίοι αφαιρέθηκαν από ασθενείς λόγω οστεοαρθρίτιδας ή άλλης αιτίας βλάβης του αρθρικού χόνδρου και καρκίνου. Οι μεταβολές στην περιοχή του φάσματος μεταξύ 1800-1400 cm-1, όπου εμφανίζονται οι χαρακτηριστικές δονήσεις των κολλαγονούχων πρωτεϊνών έδειξαν την καταστροφή της έλικας από α-έλικα, η οποία επικρατεί στην φυσιολογική κατάσταση, σε τυχαία περιέλιξη μετά την επίδραση των ιοντιζουσών ακτινοβολιών. Με αύξηση της δόσης ακτινοβολίας παράγονται αμυλοειδούς τύπου πρωτεΐνες από τα θραύσματα των πρωτεϊνών που παράγονται, λόγω της επίδρασης των ελευθέρων ριζών υδροξυλίου. Η εμφάνιση της ταινίας στα 1742 cm-1 αποδίδεται στην υπεροξείδωση των μεμβρανών των κυττάρων η οποία προκαλείται από την παρουσία του οξυγόνου, το οποίο, ως ελεύθερη δίριζα συμβάλλει στην περαιτέρω καταστροφή των ιοντιζουσών ακτινοβολιών. Η ταινία χαρακτηρίζει τον σχηματισμό μαλονδιαλδεΰδης, μία ένωση που αποτελεί δείκτη για την εξέλιξη της ασθένειας. Από τις ταινίες στην περιοχή του φάσματος μεταξύ 1400-900 cm-1 όπου εμφανίζονται οι χαρακτηριστικές δονήσεις των ομάδων –C-O-C- των σακχάρων διαπιστώνεται η αύξηση των D-σακχάρων, τα οποία προκύπτουν από την αύξηση των μονομερών. Οι εντάσεις των ταινιών αυτών εξαρτώνται από τη δόση ακτινοβολίας και αυξάνει αναλογικά μέχρι δόσεις περίπου 9 Gy. Πέραν αυτής της δόσης, οι παραγόμενες ελεύθερες ρίζες αντιδρούν περαιτέρω με βασικά βιομόρια και μεταβάλλουν την τοξική επίδραση της ακτινοβολίας. Στην περιοχή μεταξύ 1300-900 cm-1, οι ταινίες του φάσματος των σακχάρων συνυπάρχουν με τις ταινίες των φωσφορικών αλάτων του υδροξυαπατίτη των οστών. Από την μορφή των ταινιών και τις θέσεις των μεγίστων απορρόφησης φαίνεται ο σχηματισμός άμορφου φωσφορικού ασβεστίου [Ca3(ΡΟ4)2] ο οποίος προέρχεται από την αντίδραση των ιόντων ασβεστίου (Ca2+) του υγρού των χόνδρων με τις φωσφορικές ομάδες των φωσφολιπιδίων των κυτταρικών μεμβρανών. Τα FT-IR φάσματα συγκρίθηκαν με φάσματα ασθενών με οστεοαρθρίτιδα και διαπιστώθηκε ότι τα φάσματα παρουσιάζουν ομοιότητες, οι οποίες ερμηνεύονται με μηχανισμούς ελευθέρων ριζών. Η μελέτη της αρχιτεκτονικής των χόνδρων με οπτικό μικροσκόπιο και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) έδειξαν ότι η φθορά την οποία προκαλούν οι ιοντίζουσες ακτινοβολίες είναι ίδια με αυτή που προκαλεί η φυσιολογική γήρανση του ατόμου και εκδήλωση οστεοαρθρίτιδας. Τα δεδομένα της μελέτης δείχνουν ότι οι ιοντίζουσες ακτινοβολίες κατά την ακτινοθεραπεία προκαλούν σχάση των αλυσίδων των γλυκοζαμικογλυκανών και κολλαγονούχων πρωτεϊνών, οι οποίες οδηγούν σε μη αντιστρεπτές βλάβες. Οι παρατηρήσεις αυτές δείχνουν ότι θα πρέπει να αναπτυχθεί νέα σειρά θεραπευτικού σχήματος για την αντιμετώπιση των βλαβών, οι οποίες προκαλούνται στα υγιή κύτταρα τα οποία ακτινοβολούνται παράλληλα με τα παθολογικά.	el
heal.abstract	In the present study, we used Fourier transform infrared spectroscopy in combination with high resolution optical microscope and Scanning Electron Microscopy (SEM) for the in vitro evaluation of the effects of ionizing radiation on articular cartilage, the interface with the bone as well as the bone tissue itself, in order to understand the chemical mechanism of the radiation therapy induced damage. From the intensity changes of the characteristic absorption bands and the appearance of new bands in the region between 4000-2800 cm-1, it was suggested that the damage caused to small doses of radiation up to 6 Gy are the cleavages of hydrogen bonds of glycosaminoglycans (hyaluronic acid) and collagenous proteins. The fragments of collagen and hyaluronic acid reacted together by co-polymerization to form products leading to decrease the viscosity of cartilage and thus increasing friction and finally damage of the cartilage. These results were confirmed by comparison of the spectra from arthritic or cancerous cartilage from respective patients. Changes in the spectral region between 1800-1400 cm-1, where the characteristic bending vibration bands of collagen and non-cola gene proteins absorb, showed the destruction of their secondary structure from a helix, which is prevalent in the normal configuration, in a random coil after the influence of ionizing radiation. Increasing the radiation dose, amyloid-like proteins are produced from the interactions between the protein fragments, due to hydroxyl free radicals and protein interactions. The appearance of the band at 1742 cm-1 suggests the peroxidation of cell membranes and is caused by the presence of oxygen, which, as the free biradical contributes to further destruction due to ionizing radiation. The band is attributed to malondialdehyde formation, a compound that is used as marker for the disease progression. In the spectral region 1400-900 cm-1, the characteristic vibration of -C-O-C- sugar groups are found. The increasing of the intensities of these bands is related with D-sugar molecules, as a result of polysaccharide chain brakes. The intensities of these bands depend on the radiation dose and increase proportionally to doses of about 9 Gy. In higher doses it was observed that the produced mediated-organic free radicals of the biological molecules react further with essential biomolecules alterating the toxic effect of radiation. In the region between 1300-900 cm-1, the carbohydrate spectral bands coexist with the stretching vibrations of phosphate groups of hydroxyapatite bone. From the shape of bands and the positions of the absorption maxima showing the amorphous calcium phosphate formation [Ca3(PO4)2] as a result of free calcium ions (Ca2+) of the cartilage with the phosphate groups of membrane phospholipids fragments. The FT-IR spectra of irradiated cartilage were also compared with those resulting from osteoarthritic and cancerous cartilage, and was found that the spectra showed similarities indicating that the reactive species of hydroxyl radicals, electrons and oxygen are involved during irradiation as well as in osteoarthritis and cancer development. The study of cartilage surface by optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM) showed that the architecture after irradiation is similar to that caused to osteoarthritis. Data of the present study show that ionizing radiation during radiation therapy cause cleavage of glycozamikoglycan and collagenous protein chains, leading to a non reversible damage. These observations suggest that we should develop new therapeutic schemes to protect the healthy cells from radiation therapy induced damage.	en
heal.advisorName	Αναστασοπούλου, Ιωάννα	el
heal.committeeMemberName	Δημοτίκαλη, Δήμητρα	el
heal.committeeMemberName	Κουή, Μαρία	el
heal.committeeMemberName	Θεοφανίδης, Θεόφιλος	el
heal.committeeMemberName	Παπαγγελόπουλος, Π.	el
heal.committeeMemberName	Ράλλης, Μ.	el
heal.committeeMemberName	Ψαρουδάκης, Ν.	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Εργαστήριο Ακτινοχημείας και Βιοφασματοσκοπίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	117 σ.
heal.fullTextAvailability	true