Μελέτη και βιοχημικός χαρακτηρισμός της λιπολυτικής δράσης των κυττάρων του θαλάσσιου μικροφύκους Nannochloropsis oceanica

Κατσαμπέα, Αλεξάνδρα-Σοφία; Katsampea, Alexandra-Sofia

dc.contributor.author	Κατσαμπέα, Αλεξάνδρα-Σοφία	el
dc.contributor.author	Katsampea, Alexandra-Sofia	en
dc.date.accessioned	2016-10-19T08:13:35Z
dc.date.available	2016-10-19T08:13:35Z
dc.date.issued	2016-10-19
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/43840
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.13300
dc.rights	Default License
dc.subject	Μικροφύκη	el
dc.subject	Χαρακτηρισμός	el
dc.subject	Λιπολυτική δράση	el
dc.subject	Λιπάσες	el
dc.subject	Ενεργότητα	el
dc.subject	Enzymes	en
dc.subject	Lipolitic activity	en
dc.subject	Characterization	en
dc.subject	Microalgae	en
dc.subject	Lipases	en
dc.title	Μελέτη και βιοχημικός χαρακτηρισμός της λιπολυτικής δράσης των κυττάρων του θαλάσσιου μικροφύκους Nannochloropsis oceanica	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία μικροοργανισμών	el
heal.classificationURI	http://data.seab.gr/concepts/523dbca59ed539b76aeb249f2bb99717e146c4d5
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2016-09-30
heal.abstract	Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της λιπολυτικής δράσης των κυτταρικών θραυσμάτων του θαλάσσιου μικροφύκους Nannochloropsis oceanica. Εξαιτίας της πληθώρας των βιοτεχνολογικών εφαρμογών της ενζυμικής κατάλυσης, η ανάγκη εύρεσης νεων ενζυμικών δράσεων από μικροοργανισμούς κρίνεται απαραίτητη. Το στέλεχος καλλιεργήθηκε σε φωτοαντιδραστήρα, όπου ο φωτισμός ήταν συνεχής και η θερμοκρασία παρέμενε σταθερή στους 20οC. Mετρήθηκε η κυτταρική ανάπτυξη του στελέχους Nannochloropsis oceanica και στη συνέχεια συλλέχθηκαν τα κύτταρα της καλλιέργειας. Ακολούθησε λύση των κυττάρων με τη χρήση της συσκευής υπερήχων και παραλαβή των κυτταρικών θραυσμάτων (debris). Στη συνέχεια υπολογίστηκε το πρωτεϊνικό περιεχόμενο του ενζυμικού σκευάσματος (θραύσματα κυττάρων επαναιωρημένα σε ρυθμιστικό διάλυμα με τιμή pH 7.0) σύμφωνα με τη μέθοδο Lowry και βρέθηκε ίση με 2.5 μg πρωτεϊνης/mg ξηρής βιομάζας. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της λιπολυτικής ικανότητας των κυτταρικών θραυσμάτων του μικροοργανισμού μέσω αντίδρασης υδρόλυσης σε θερμοκρασία 30οC, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα διάλυμα παρα-νίτρο-φαίνυλο λαυρικού οξέος. Ακολούθως, μελετήθηκε η θερμοσταθερότητα του ενζυμικού σκευάσματος σε θερμοκρασίες 40-90οC και βρέθηκε ότι διατηρεί το 100% της ενεργότητας του σε θερμοκρασίες έως 50οC για 1 ώρα επώασης, ενώ διατηρεί πάνω από το 80% της ενεργότητας του σε θερμοκρασίες έως 60οC για 2 ώρες επώασης. Επιπλέον, υπολογίστηκαν οι σταθερές απενεργοποίησης, η ενέργεια ενεργοποίησης της αντίδρασης υδρόλυσης (70.3 kJ/mol) και οι χρόνοι ημιζωής του ενζυμικού σκευάσματος καθώς επίσης και η μεταβολή της ενθαλπίας και εντροπίας του συστήματος. Το ενζυμικό σκεύασμα χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση της υποστρωματικής εξειδίκευσης με τη χρήση έξι διαφορετικών εστέρων της παρα-νιτροφαινόλης με λιπαρά οξέα διαφορετικού μήκους ανθρακικής αλυσίδας (C2-C16) και βρέθηκε ότι παρουσιάζει μεγαλύτερη εξειδίκευση σε υποστρώματα με μεγάλο μήκος ανθρακικής αλυσίδας. Ακολούθησε η εύρεση των κινητικών σταθερών της αντίδρασης υδρόλυσης για τρία διαφορετικά υποστρώματα (παρα-νίτρο-φαίνυλο-οκτανοϊκό οξύ, παρα-νίτρο-φαίνυλο-λαυρικό οξύ και παρα-νίτρο-φαίνυλο-παλμιτικό οξύ). Από τη μελέτη αυτή προέκυψε πως το ενζυμικό σκεύασμα εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια, δηλαδή μικρότερη σταθερά Κm, με τον εστέρα με του παλμιτικού οξέος (16 άτομα άνθρακα). Όσον αφορά στο pH, το ενζυμικο σκευασμα εμφανίστηκε αρκετά σταθερο σε ένα ευρύ φάσμα τιμών και ως βελτιστη τιμή δράσης ήταν το 7.0.Το συμπέρασμα που προέκυψε ήταν ότι το ενζυμικό σκεύασμα διατηρεί πάνω από το 80% της ενζυμικής του ενεργότητας μετά από 1 ώρα επώασης σε τιμές pH 6.0-8.0, σε θερμοκρασία 30οC. Τέλος, διαπιστώθηκε η επίδραση διαφόρων οργανικών διαλυτών, μεταλλικών ιόντων και επιφανειοδραστικών ενώσεων στην ενζυμική ενεργότητα του ενζυμικού σκευάσματος. Σε ότι αφορά τους οργανικούς διαλύτες, το ενζυμικό σκεύασμα έδειξε ιδιαίτερη αντοχή μετά από επώαση 24 ωρών σε n-οκτάνιο, αιθανόλη και ακετονιτρίλο. Τα αποτελέσματα της επώασης σε μεταλλικά ιόντα επέδειξαν αύξηση της ενεργότητας του ενζυμικού σκευάσματος μετά από επώαση 1 ώρας σε MgCl2 και MnCl2, ενώ μετά από επώαση σε ZuSO4, CuSO4 και FeCl3 το ενζυμικό σκεύασμα διατήρησε λιγότερο από το 50% της αρχικής του ενεργότητας. Η επώαση σε επιφανειοδραστικές ενώσεις παρουσίασε αύξηση της ενεργότητας του ενζυμικού σκευάσματος μετά από επώαση στο SDS, ενώ για τις υπόλοιπες χρησιμοποιούμενες ενώσεις παρουσιάστηκε μείωση της ενζυμικής ενεργότητας.	el
heal.abstract	The purpose of this diploma thesis was the biochemical characterization of the lipolytic activity of cell debris of a marine microalgae, Nannochloropsis oceanica. Because of the variety of biotechnological applications of enzymatic catalysis, it is crucial to find new enzyme activities from microorganisms. The strain N.oceanica was grown in 1L Erlenmeyer flasks containing sterilized seawater enriched with F/2 medium nutrients under aseptic conditions on an orbital shaker at 120rpm. The temperature was stable (20oC) and light intensity was used. The cell growth of N. oceanica was measured, and then the cells were harvested. The next step was cell lysis using the sonication devise and collection of cell debris. Then, the protein content of the enzyme formula (cell debris in a buffer with pH value 7.0) was determined according to the Lowry method and found to be equal to 2.5 μg proteins/mg of dry cell biomass. Initially, a determination of the lipolytic activity of cell debris of the microorganism via hydrolysis reaction at 30°C using as substrate solution the p-nitro-phenyl lauric acid (pNP-L) took place. Subsequently, the thermostability of enzyme formula was studied at temperatures of 40-90oC and it was found to retain 100% of its activity at temperatures up to 50oC for 1 hour of incubation, while maintaining more than 80% of its activity at temperatures up to 60°C for 2 hours of incubation. In addition, inactivation constants, activation energy of hydrolysis reaction (70.3 kJ/mol), and half-lives of the enzyme formula were calculated as well as the variation of enthalpy and entropy of the system. The enzyme formula was used to investigate the specificity of substrate using six different esters of p-nitrophenol with fatty acids of different carbon chain length (C2-C16) and it was found that shows greater specificity in substrates with long carbon chain. Subsequently, the kinetic constants of hydrolysis reaction for three different substrates (para-nitrophenyl-octanoate, para-nitrophenyl-laurate and para-nitrophenyl-palmitate) were found. This study showed that the enzyme formula shows higher affinity, i.e. smaller Km constant , with the ester of palmitic acid (16 carbon atoms). Regarding the pH value, the enzyme formula appeared to be quite stable in a wide pH range and optimum activity value was pH 7.0. The conclusion was that the enzyme formula retains more than 80% of its initial activity after 1 hour of incubation at pH values 6.0-8.0, at 30°C. Finally, the effect of various organic solvents, metal ions and surfactants to the enzymatic activity of the formula was found. With respect to organic solvents, the enzyme formula showed high tolerance after 24 hours incubation in n-octane, ethanol, and acetonitrile. The results of the incubation in metal ions showed increased activity of the enzyme formula after incubation for 1 hour in MgCl2 and MnCl2, while after incubation in ZuSO4, CuSO4 and FeCl3 the enzyme formula retained less than 50% of its initial activity. Incubation in surfacants showed increased activity of the enzyme formula after incubation in SDS, whereas the other surfactants showed significant inhibition effect on the enzymatic activity.	en
heal.advisorName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Καλογήρου, Ιωάννης	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	113 σ.	el
heal.fullTextAvailability	true