In-situ microscopy for online monitoring of yeast propagation in culture broths

Κλάδης, Γεώργιος; Kladis, Georgios

dc.contributor.author	Κλάδης, Γεώργιος	el
dc.contributor.author	Kladis, Georgios	en
dc.date.accessioned	2017-02-15T10:32:41Z
dc.date.issued	2017-02-15
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/44363
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.13443
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Μικροσκοπία φωτός	el
dc.subject	Ζύμη	el
dc.subject	Συγχρονισμός καλλιέργειας	el
dc.subject	In-situ light microscopy	en
dc.subject	Yeast	en
dc.subject	Synchronization	en
dc.title	In-situ microscopy for online monitoring of yeast propagation in culture broths	en
heal.type	bachelorThesis
heal.generalDescription	H παρούσα διπλωματική πραγματοποιήθηκε εξ ολοκλήρου στο εργαστήριο Bioprocess Engineering του TU Berlin	el
heal.classification	Biotechnological process monitoring	en
heal.classificationURI	http://id.loc.gov/authorities/subjects/sh91005911
heal.dateAvailable	2018-02-14T22:00:00Z
heal.language	en
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2016-09
heal.abstract	Η ανταγωνιστικότητα της σύγχρονης εποχής καθιστά επιτακτική την βελτιστοποίηση κάθε σταδίου της παραγωγικής διαδικασίας ενός προϊόντος. Η πρόκληση αυτή περιλαμβάνει φυσικά και την αυτή καθ’αυτή παραγωγή του προϊόντος σε αντιδραστήρες βιομηχανικής κλίμακας. Οι αντιδραστήρες αυτοί, όμως, εξαιτίας των τεραστίων διαστάσεών τους, λειτουργούν σε συνθήκες μακριά από ιδανικές. Η παραδοχή της συνεχούς ανάδευσης, η οποία μεταφράζεται σε ομοιογενείς συνθήκες σε όλη την έκταση του αντιδραστήρα περιορίζεται σε μικρές περιοχές γύρω από τον αναδευτήρα, ενώ στην υπόλοιπη έκταση του αντιδραστήρα δημιουργούνται βαθμίδες διαφόρων ειδών (υπόστρωματος, διαλυμένου οξυγόνου, διαλυμένου διοξειδίου του άνθρακα κλπ). Το φαινόμενο αυτό γίνεται πιο αισθητό όσο μεγαλύτερο ιξώδες έχει το περιεχόμενο του ανιδραστήρα. Αυτό με την σειρά του προκαλεί περαιτέρω προβλήματα: ανομοιγενή συστήματα είναι πολύ δύσκολο να παρακολουθηθούν και κατά συνέπεια να ελεγχούν. Για να παρθεί μία ρεαλιστική εικόνα του τι γίγνεθαι στο εσωτερικό του αντιδραστήρα, χρειάζονται πολλαπλές δειγματοληψίες από διαφορετικά τμήματα του αντιδραστήρα. Η ανάλυσή τους περιλαμβάνει στην συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων χρήση μεθόδων και οργάνων at-line και off-line. Η διαδικασία αυτή απετεί αφενός εργατοώρες και χρόνο και αφετέρου, επειδή ακριβώς χρειάζεται χρόνο, δεν δίνει την δυνατότητα για γρήγορη αντίδραση και την λήψη κατάλληλων μέτρων, όταν συγκεκριμένες συνθήκες στο αντιδραστήρα αλλάζουν. Μία ρηξικέλευθη μέθοδος είναι η χρήση online αναλυτικών οργάνων και συγκεκριμένα η in-situ μικροσποπία φωτός, η οποία χρησιμοποείται σε αυτήν την έρευνα. Η in-situ μικροσκοπία φωτός αποτελείται από ένα μικροσκόπιο, το οποίο χρησιμοποεί φως στο ορατό φάσμα και μεγεθύνει και τραβά φωτογραφίες των κυττάρων, ενώ είναι τοποθετημένος μέσα στον αντιδραστήρα. Οι εικόνες αυτές επεξεργάζονται απο λογισμικό ανάλυσης εικόνας και παρέχει πληροφορίες για την κατανομή μεγέθους κυττάρων, αριθμό κυττάρων, διακύμανση μεγέθους κλπ. Εμπορικά υπάρχουν διαθέσιμα μικροσπόπια, τα οποία λειτουργούν at-line και off-line. Σε αυτήν την έρευνα, ένα μικροσκόπιο φωτός in-situ της εταιρείας SOPAT (Smart Online Particle Analysis Technology) χρησιμοποιήθηκε για να μετρήσει την κατανομή μεγέθους κυττάρων ζύμης S.Cerevisiae καλλιεργημένα σε αντιδραστήρα συνεχούς ανάδευσης και scale-down ανακινούμενων δοχείων σε ευνοϊκές και μη ευνοϊκές συνθήκες. Τα αποτελέσματα έγιναν σε αντιπαραβολή με αποτελέσματα από ένα μικροσκόπιο at-line της εταιρείας Ovizio και άλλων off-line μεθόδων, όπως HPLC, GC-FID, pH, OD κλπ. Έγιναν 4 σειρές πειραμάτων με ζύμη S.Cerevisiae, τα οποία πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο του Chair of Bioprocess Engineering του TU Berlin στο Βερολίνο. H πρώτη σειρά πραγματοποιήθηκε σε αντιδραστήρα συνεχoύς ανάδευσης 10 L. H προετοιμασία και η ανάπτυξη της καλλιέργειας έγινε σε ανακινούμενα δοχεία (shake flasks) σε 3 φάσεις με την τελική να φτάνει σε οπτική πυκνότητα (OD) 10. Έπειτα ξεκίνησε η πρώτη φάση της καλλιέργειας, η οποία ήταν σε συνθήκες αντιδραστήρα διαλείποντος έργου (batch), o οποίος είχε αποστηρωθεί προηγουμένως. Συνολικά 9.5 L μίγματος μικροοργανισμών και μέσου ανάπτυξης παρέμειναν στον αντιδραστήρα για περίπου 20 ώρες, έως ότου η οπτική πυκνότητα (OD) έφτασε 24. Έπειτα για τις επόμενες 13 ώρες, ο αντιδραστήρας μετατράπηκε σε ημιδιαλείποντος έργου, με την τροφοδοσία να υπολογίζεται μέσω της F=kvLeμt, όπου μ=0.12h-1 και k=0,00318h-1. Oι συνθήκες ήταν σταθερές σε όλη τη διάρκεια του πειράματος με pH=5.5 και θερμοκρασία T=27oC. Κάθε μία ώρα υπήρχε δειγματοληψία και ο αισθητήρας SOPAT, ο οποίος ήταν προσαρτημένος στον αντιδραστήρα, έπαιρνε μετρήσεις κάθε 20 λεπτά και στις 2 φάσεις του πειράματος. Τα επόμενα 2 πειράματα έγιναν σε ανακινούμενα δοχεία shake flasks, με σκοπό την χρήση του αισθητήρα SOPAT για να παρακολουθηθεί ο κύκλος ανάπτυξης της ζύμης S.Cerevisiae. Για να γίνει ευκολότερη η παρακολούθηση, η καλλιέργεια εκτέθηκε στην ουσία Nocodazole, η οποία συγχρονίζει τα κύτταρα του μικροοργανισμού, ωτσε να βρίσκονται στο ίδιο σημείο του αναπαραγωγικού κύκλου (cell cycle) στην φάση G2/M. Τα δύο πειράματα εκτυλίχθηκαν στις ίδιες ακριβώς συνθήκες, με μόνη διαφορά ότι το μέσο ανάπτυξης στο δεύτερο πείραμα είχε μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε πηγή άνθρακα – δεξτρόζη (απο 1.65 σε 22 gr/L), ώστε να αποφευχθούν συνθήκες περιορισμού υποστρώματος άνθρακα και επίσης ο αισθητήρας SOPAT προσαρμόστηκε σε εστιάση στα 0.2mm συγκριτικά με το πρώτο πείραμα όπυ η εστίαση ήταν στα 2mm, ώστε να προκύψουν εικόνες μεγαλύτερης ευκρίνειας. Η προετοιμασία της καλλιέργειας έγινε πάλι σε 3 φάσεις με την τελική να φτάνει οπτική πυκνότητα (ΟD) 0.6 σε 8 διαφορετικά ανακεινούμενα δοχεία όγκου 35 ml έκαστος, όπου και μετά αναμείχθηκαν μεταξύ τους χρησιμοποιήθηκαν για το πείραμα. Το πρώτο πείραμα διήρκεσε 4.5 ώρες και το δεύτερο 3 ώρες. Η δειγμαοληψία γινόταν κάθε μισή ώρα και ο αισθητήρας SOPAT έπαιρνε μετρήσεις κάθε 10 λεπτά. Το τελευταίο πείραμα αφορούσε την μελέτη της κατανομής μεγέθους των κυττάρων όταν εκτεθούν σε 2 είδη δυσμενών συνθηκών: σε συνθήκες με υψηλή συγκέντρωση αιθανόλης και συνθήκες με υψηλή συγκέντρωση οξικού οξέος. Η προετοιμασία της καλλιέργειας ήταν κοινή με την προτεοιμασία της καλλιέργειας όπως με το πείραμα στον αντιδραστήρα συνεχούς ανάδευσης. Παρασκευάστηκαν 6 πανομοιότυπα δοχείαμε 50 ml διαλύματος έκαστος. Στα 2 προστέθηκαν αιθανόλη με τελική συγκέντρωση στο δοχείο 120mM, στα επόμενα 2 προστεθηκε οξικό οξύ με τελική συγκέντρωση 20mM και στα τελευταια 2 δεν προστέθηκε οτιδήποτε, ώστε στο τέλος να συγκριθούν τα αποτελέσματα. Δειγματοληψία έγινε στο ξεκίνημα του πειράματος, στην μιση ώρα, στην μία ώρα και στις 2 ώρες από την έναρξη του πειράματος. Παράλληλα στα ίδια χρονικά σημεία, χρησιμoποιήθηκε και ο αισθητήρας SOPAT. Τα αποτελέσματα είναι πολλά υποσχόμενα, αφού προσφέρουν καλή συσχέτιση με δεδομένα από αναλύσεις at-line και off-line πολύ πιο σύντομα και με λιγότερο κόπο. Συγκεκριμένα επιτεύχθηκε συσχέτιση συγκριτικά με δεδομένα από τρισδιάστατο μικροσκόπιο της τάξης του 92%. Η αναγνώριση των κυττάρων, όμως, έχει μεγάλα περιθώρια βελτίωσης τόσο την αναγνώριση τους ακριβές μεγέθους των κυττάρων, όσο και της ακρίβειας σε μεγάλες συγκεντρώσεις. Για αυτόν τον λόγο, δοκιμάστηκε ένα νέο σετ παραμέτρων στο λογισμικό του αισθητήρα SOPAT, το οποίο μπορούσε σταθερά να εντοπίζει και να μετρά τουλάχιστον 1000 κύτταρα ανά λήψη. Όμως η βελτίωση αυτή έγινε σε βάρος της ακρίβειας της μέτρησης ως προς το μέγεθος των κυττάρων και ταυτόγχρονα κύτταρα λίγο πριν την διαίρεση προσμετρόνταν για 2.	el
heal.abstract	Contemporary times request optimization of every possible aspect of the product value chain. This challenge includes, also, the very process of producing products inside large-scale reactors. These reactors, though, because of their great dimensions, work in conditions far from ideal. The concept of continuous stirring, which promises homogeneous conditions across the volume of the reactor is restricted to just a small volume around the stirrer, whereas across the rest of the reactor gradients of many kinds occur (substrate, DO, pH, dissolved carbon dioxide etc). This phenomenon becomes worse, the more viscous the reactor’s solution is. This, in turn, poses a much more serious problem: inhomogeneous conditions are very difficult to monitor and subsequently to control. In order to get a realistic picture of what’s happening inside the reactor, multiple sampling from different regions should be taken. The analysis in the vast majority of situations include at-line and off-line analytic tools. This procedure, though, is in one hand rigorous and requires time and work, and on the other hand, since it is time consuming, it doesn’t offer the possibility to quickly react and take the appropriate measures, if certain conditions in the reactor change. A novel solution for this problem is online analytic tools, and specifically in-situ light microscopy, which was used in this study. In-situ light microscopy, consists of a microscope that uses light in the visible range to magnify and take pictures of the suspended cells, while mounted inside the reactor. These pictures are then processed by image-analysis software and provides information about the cell size distribution, cell count, variance of size etc. Commercially there have been microscopes that work, though, at-line and off-line. In this study, an in-situ light microscopy sensors, SOPAT (Smart Online Particle Analysis Technology), was used to measure the cell size distribution of yeast cells S.Cerevisiae cultivated in a CSTR reactor and in scale-down shake flasks under optimum and non-optimum conditions. The results were compared with results from at-line microscopy Ovizio and off-line analytics, which included HPLC, GC-FID, glucose, pH, OD etc. The results are very promising, providing good correlation with at-line analytics at a much faster and less rigorous way. The detection, though, still needs to be improved, since it loses accuracy in high cell concentrations.	en
heal.sponsor	Erasmus+ Program	en
heal.advisorName	Junne, Stefan	en
heal.advisorName	Λυμπεράτος, Γεράσιμος	el
heal.committeeMemberName	Λυμπεράτος, Γεράσιμος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Μπεάζη-Κατσιώτη, Μαργαρίτα	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	73 σ.	el
heal.fullTextAvailability	true