ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ Escherichia coli ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΣΥΣΤΗΜΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ.

ΓΙΑΛΑΜΑ, ΔΗΜΗΤΡΑ; GIALAMA, DIMITRA

dc.contributor.author	ΓΙΑΛΑΜΑ, ΔΗΜΗΤΡΑ	el
dc.contributor.author	GIALAMA, DIMITRA	en
dc.date.accessioned	2017-05-30T09:18:38Z
dc.date.available	2017-05-30T09:18:38Z
dc.date.issued	2017-05-30
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/44938
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.2756
dc.rights	Default License
dc.subject	ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ	el
dc.subject	ΚΑΤΑΣΤΟΛΕΑΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ DjlA	el
dc.subject	ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΣΤΟ Escherichia coli	el
dc.subject	ΚΑΤΑΣΤΟΛΕΑΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ RraA	el
dc.subject	ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ	el
dc.subject	MEMBRANE PROTEIN TOXICITY	en
dc.subject	OVEREXPRESSION IN Escherichia coli	el
dc.subject	SUPPRESSOR OF TOXICITY RraA	el
dc.subject	SUPPRESSOR OF TOXICITY DjlA	el
dc.subject	TOLERANT STRAIN ENGINEERING	el
dc.title	ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ Escherichia coli ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΣΥΣΤΗΜΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ.	el
dc.title	MODIFICATION AND STUDY OF Escherichia coli BACTERIAL STRAINS WITH THE AIM TO PRODUCE MEMBRANE PROTEINS USING SYSTEMS BIOLOGY METHODS.	en
dc.contributor.department	Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών. Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας.	el
heal.type	doctoralThesis
heal.classification	ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ	el
heal.classification	BIOTECHNOLOGY	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2017-05-22
heal.abstract	Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες περιλαμβάνουν σημαντικές πρωτεϊνικές οικογένειες, όπως υποδοχείς συζευγμένους με πρωτεΐνες G, μεταφορείς και κανάλια. Το επιστημονικό ενδιαφέρον για αυτές είναι ιδιαίτερα αυξημένο και καθώς είναι εξαιρετικά σημαντικοί στόχοι για φάρμακα, προσελκύουν το ενδιαφέρον και της φαρμακοβιομηχανίας. Ενδιαφέρον υπάρχει για το χαρακτηρισμό των μεμβρανικών πρωτεϊνών όπως και για την απόκτηση πληροφοριών για τον ορθολογικό σχεδιασμό φαρμάκων. Για αυτούς τους σκοπούς απαιτούνται μεγάλες ποσότητες πρωτεΐνης, οι οποίες συνήθως παράγονται από υπερέκφραση σε ετερόλογους οργανισμούς. Το βακτήριο Escherichia coli είναι το πιο δημοφιλές μέσο υπερπαραγωγής μεμβρανικών πρωτεϊνών, όμως, ακόμη και η ανασυνδυασμένη παραγωγή με αυτό το βακτήριο είναι πολλές φορές προβληματική. Οι αποδόσεις ανά κύτταρο είναι συνήθως μικρές και η παραγωγή μεμβρανικών πρωτεϊνών είναι συχνά τοξική για τα κύτταρα με αποτέλεσμα τη χαμηλή συνολική παραγωγικότητα. Οι στόχοι της παρούσας εργασίας ήταν να κατασκευαστούν στελέχη Escherichia coli ικανά να ανθίστανται στην τοξικότητα υπερπαραγωγής μεμβρανικών πρωτεϊνών, αλλά και να διερευνηθούν στοιχεία του μηχανισμού της παρατηρούμενης κυτταροτοξικότητας. Έτσι, κατασκευάστηκαν βιβλιοθήκες από μεταλλαγμένα βακτήρια που έφεραν διαφορετικές γενετικές τροποποιήσεις και χρησιμοποιήθηκαν κατάλληλες γενετικές αναλύσεις για την απομόνωση των επιθυμητών κλώνων. Οι αναλύσεις κατέληξαν στον εντοπισμό δύο νέων παραγόντων που κατά τη συνέκφρασή τους βελτιώνουν την υπερέκφραση μεμβρανικών πρωτεϊνών, τα γονίδια djlA και rraA. Η DjlA είναι ένας ενεργοποιητής της μοριακής συνοδού DnaK, ενσωματωμένος στη μεμβράνη και είναι παρόμοιος με τη DnaJ, και η RraA είναι αναστολέας της ριβονουκλεάσης RNάσης E. Έτσι, κατασκευάστηκαν δύο στελέχη E. coli που υπερεκφράζουν το γονίδιο djlA ή rraA και ονομάστηκαν SuptoxD και SuptoxR, αντίστοιχα. Κατά την υπερέκφραση μεμβρανικών πρωτεϊνών η ανάπτυξη των στελεχών αυτών είναι δραματικά βελτιωμένη σε σχέση με τα αγρίου τύπου κύτταρα. Επιπροσθέτως, τα επίπεδα έκφρασης των μεμβρανικών πρωτεϊνών ανά κύτταρο είναι σημαντικά βελτιωμένα. Η εφαρμογή των στελεχών βρέθηκε να είναι γενική καθώς βελτιώνουν την υπερέκφραση πολλών ευκαρυωτικών και προκαρυωτικών μεμβρανικών πρωτεϊνών σε σχέση με τα αγρίου τύπου κύτταρα και με τα εμπορικά στελέχη που θεωρούνται κατάλληλα για την υπερπαραγωγή μεμβρανικών πρωτεϊνών. Ανάμεσα σε αυτές τις πρωτεΐνες ήταν και ο υποδοχέας νευροτενσίνης 1, του οποίου η λειτουργικότητα εξετάστηκε και βρέθηκε ότι η επιπλέον παραγόμενη πρωτεΐνη είναι λειτουργική. Κατόπιν, διερευνήθηκαν στοιχεία του μηχανισμού λειτουργίας των δύο καταστολέων της τοξικότητας. Συγκεκριμένα, εξετάστηκε ο ρόλος των διαφορετικών υπομονάδων της DjlA στην επίδραση της υπερπαραγωγής του υποδοχέα βραδυκινίνης 2 (BR2) και βρέθηκε ότι ολόκληρο το μόριο της DjlA απαιτείται για την καταστολή της τοξικότητάς του. Επίσης, η ευεργετική επίδραση της DjlA στην υπερπαραγωγή μεμβρανικών πρωτεϊνών ήταν εξειδικευμένη, ενώ η εξειδίκευση της J υπομονάδας της DjlA ήταν περιορισμένη. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η μοριακή συνοδός DnaK παίζει κρίσιμο ρόλο, καθώς η αλληλεπίδραση με την DjlA είναι απαραίτητη για τη βελτίωση της υπερπαραγωγής του BR2. H DjlA και η RraA βρέθηκαν να δρουν με ανεξάρτητο μηχανισμό η μία από την άλλη στη βελτίωση της υπερπαραγωγής της πρωτεΐνης BR2, με μη προσθετικό όμως τρόπο. Τέλος, όσον αφορά στο μηχανισμό λειτουργίας του RraA βρέθηκε ότι η υπερέκφραση του BR2 βελτιώνεται χωρίς να επηρεάζονται τα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου του κατά την υπερέκφραση του rraA. Αναμένεται ότι τα στελέχη SuptoxD και SuptoxR θα χρησιμοποιηθούν ευρέως από την επιστημονική κοινότητα και θα διευκολύνουν τη διαλεύκανση του μηχανισμού της εν λόγω κυτταροτοξικότητας.	el
heal.abstract	Membrane proteins include protein families such as G protein-coupled receptors, channels and transporters. Currently, there is increasing scientific interest in the field and as membrane proteins are extremely important drug targets they attract the attention of the pharmaceutical industry. For characterization of membrane proteins and acquisition of information for the rational design of drugs large amounts of protein are required. As their natural abundance is usually very low, membrane proteins are produced by overexpression in heterologous hosts. Escherichia coli is the most popular overexpression vehicle, however, overexression in this bacterium can be problematic. Their yields per cell are typically low and membrane protein production is highly toxic to cells. The aim of the present work is to engineer Escherichia coli strains that overcome MP-overexpression toxicity and, also, to investigate aspects of the mechanism behind the observed cytotoxicity. For this purpose we have generated libraries of mutant bacteria carrying different types of genetic modifications and used appropriate genetic screens to isolate the desired clones. The screens resulted in the identification of two new factors that upon coexpression enhance membrane protein overexpression. DjlA is a membrane-embedded cochaperone of DnaK, similar to DnaJ, and RraA is an inhibitor of the ribonuclease RNase E. In this way, two E. coli strains were engineered, SuptoxD and SuptoxR, whose growth is dramatically improved during membrane protein overexpression compared to wild-type cells. Additionally, the expression levels of membrane proteins per cell are significantly improved. Importantly, the strains can be generally used for membrane proteins as they were shown to improve the overexpression of a number of toxic eukaryotic and prokaryotic membrane proteins compared to not only wild type cells, but also commercial strains that are suitable for this purpose. Neurotensin receptor 1 was one of these proteins and apart from the increase in its expression levels it was shown that the extra produced protein is functional. Then, aspects of the mechanism of function of the two suppressors of toxicity were investigated. Specifically, the role that the DjlA subunits play in the effect on overexpression of bradykinin receptor 2 (BR2) was examined and it was found that full-length DjlA was required for the suppression of its toxicity. Also, the beneficial effect of DjlA in the overexpression of membrane proteins was highly specific, whereas the specificity of the J domain of DjlA was found to be restricted. Additionally, the molecular chaperone DnaK plays a crucial role as its interaction with DjlA is required for the improvement of BR2 overproduction. DjlA and RraA were found to act independently, though their effects were not additive. Finally, regarding the mechanism of function of RraA it was found that BR2 overexpression is improved without affecting the levels of the transcription of its gene upon rraA coexpression. It is anticipated that the strains SuptoxD and SuptoxR will be used extensively by the scientific community and will facilitate the elucidation of the mechanism of membrane protein overexpression cytotoxicity.	en
heal.advisorName	ΚΟΛΙΣΗΣ, ΦΡΑΓΚΙΣΚΟΣ	el
heal.committeeMemberName	ΚΟΛΙΣΗΣ, ΦΡΑΓΚΙΣΚΟΣ	el
heal.committeeMemberName	ΧΑΤΖΗΝΙΚΟΛΑΟΥ, ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ	el
heal.committeeMemberName	ΣΚΡΕΤΑΣ, ΓΕΩΡΓΙΟΣ	el
heal.committeeMemberName	ΚΕΚΟΣ, ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ	el
heal.committeeMemberName	ΤΟΠΑΚΑΣ, ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ	el
heal.committeeMemberName	ΛΥΜΠΕΡΑΤΟΣ, ΓΕΡΑΣΙΜΟΣ	el
heal.committeeMemberName	ΖΩΓΡΑΦΟΣ, ΣΠΥΡΟΣ	el
heal.academicPublisher	Σχολή Χημικών Μηχανικών	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	172
heal.fullTextAvailability	true