Παραγωγή και χαρακτηρισμός μιας καινοτόμου λακκάσης από το θερμόφιλο ασκομύκητα Myceliophthora thermophilα

Κουτρουφίνη, Ευθυμία; Koutroufini, Efthymia

dc.contributor.author	Κουτρουφίνη, Ευθυμία	el
dc.contributor.author	Koutroufini, Efthymia	en
dc.date.accessioned	2017-07-18T08:42:47Z
dc.date.available	2017-07-18T08:42:47Z
dc.date.issued	2017-07-18
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/45258
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.14161
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Ένζυμα	en
dc.subject	Λακκάση	el
dc.subject	Βιοτεχνολογικές εφαρμογές	en
dc.subject	Μικροοργανισμοί	en
dc.subject	Enzymes	en
dc.subject	Laccase	en
dc.subject	Biotechnological applications	en
dc.subject	Myceliophthora thermophile	en
dc.title	Παραγωγή και χαρακτηρισμός μιας καινοτόμου λακκάσης από το θερμόφιλο ασκομύκητα Myceliophthora thermophilα	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classificationURI	http://data.seab.gr/concepts/17d26c7ad4b1baa3e1976533f499eef793ef5338
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2017-02-22
heal.abstract	Περίληψη Οι λακκάσες (βενζενεδιόλη: οξειδοαναγωγάση οξυγόνου, EC 1.10.3.2) ανήκουν στην ευρύτερη κατηγορία των οξειδωτικών ενζύμων που φέρουν πολλαπλούς χαλκούς στο ενεργό τους κέντρο και χρησιμοποιούνται σε πλήθος βιοτεχνολογικών εφαρμογών. Το ενδιαφέρον για τις λακκάσες αυξάνεται διαρκώς λόγω των πλεονεκτημάτων που εμφανίζουν ως βιοκαταλύτες και επικεντρώνεται στην έκφραση νέων λακκασών από τις καλύτερες δυνατές πηγές, τη διερεύνηση της δομής, των ιδιοτήτων και του μηχανισμού δράσης τους. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η παραγωγή και ο χαρακτηρισμός μιας καινοτόμου λακκάσης (MtLac2) από το θερμόφιλο μύκητα Myceliophthora thermophila. Αρχικά εξετάστηκε η επίδραση φυσικοχημικών παραγόντων κατά την ετερόλογη παραγωγή της MtLac2 από το μεθυλότροφο ζυμομύκητα P. pastoris και προσδιορίστηκε η συγκέντρωση μεθανόλης (1% v/v) και χαλκού (0,025 mM) όπου επιτυγχάνεται μέγιστη παραγωγή λακκάσης. Η βελτιστοποίηση ως προς τη συγκέντρωση χαλκού αύξησε την παραγωγή του ενζύμου κατά 125% ενώ ως προς τη συγκέντρωση μεθανόλης 35,5%. Επίσης προσδιορίστηκε η βέλτιστη θερμοκρασία επώασης της καλλιέργειας (30 οC). Στη συνέχεια, η MtLac2 απομονώθηκε με σκοπό το βιοχημικό χαρακτηρισμό της. Αρχικά προσδιορίστηκε πειραματικά το μοριακό βάρος (80 και 110kDa) και το ισοηλεκτρικό σημείο (pI=4) του ενζύμου. Με επεξεργασία των πειραματικών αποτελεσμάτων και βιοπληροφορικών δεδομένων, η έκφραση του ενζύμου ως δυο πρωτεϊνικά μόρια αποδόθηκε σε διαφορετικά πρότυπα Ο-γλυκοζυλίωσης. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες δράσης της MtLac2 καθώς και η σταθερότητα του ενζύμου στις διακυμάνσεις του pH και της θερμοκρασίας. Η δραστικότητα του ενζύμου είναι υψηλή στην περιοχή pH 3-4.5, ενώ σε βασικές και ουδέτερες τιμές pH μηδενίζεται. Το ένζυμο παρουσίασε υψηλή ενεργότητα στους 50 οC όπου ο χρόνος ημιζωής του είναι μεγαλύτερος από 24 ώρες, επομένως μπορεί να χαρακτηριστεί ως θερμόφιλο. Κατά τη μελέτη της δράσης του ενζύμου παρουσία οργανικών διαλυτών και παρεμποδιστών, η MtLac2 παρουσίασε ικανοποιητική ανθεκτικότητα σε όλες τις ενώσεις που δοκιμάστηκαν, ενώ το αζίδιο του νατρίου φάνηκε να επιφέρει την ισχυρότερη παρεμπόδιση. Ο χαρακτηρισμός του ενζύμου ολοκληρώθηκε με τη μελέτη εξειδικευμένης δράσης του σε μεγάλο εύρος φαινολικών υποστρωμάτων, το ABTS και το ασκορβικό οξύ, καθώς και με μελέτη της κινητικής της MtLac2 στα υποστρώματα ABTS και 2,6-DMP. Από τα αποτελέσματα φαίνεται ότι η MtLac2 έχει πιθανότατα χαμηλό οξειδοαναγωγικό δυναμικό καθώς δεν εμφανίζει πολύ υψηλή ενεργότητα στα μελετούμενα υποστρώματα. Ακόμη, το ένζυμο συνολικά παρουσίασε πολύ διαφορετικά καταλυτικά χαρακτηριστικά σε σχέση με τις περισσότερες χαρακτηρισμένες λακκάσες κυρίως λόγω της υψηλής ενεργότητας που έδειξε στο ασκορβικό οξύ. Στο τελευταίο μέρος της εργασίας η MtLac2 αξιολογήθηκε βιοτεχνολογικά σε διάφορες εφαρμογές βιομηχανικού ενδιαφέροντος. Η καινοτόμος λακκάση χρησιμοποιήθηκε στη δοκιμή αποτοξικοποίησης απόβλητου ελαιουργείου (ΥΑΕ), στην ενζυμική τροποποίηση εμπορικής γλυκάνης και στη βιοσύνθεση σουλφουρετίνης από βουτεΐνη. Από τις τρείς εφαρμογές η λακκάση έδρασε βέλτιστα στην οργανική σύνθεση, η οποία κρίθηκε επιτυχής, ενώ στην περίπτωση της ενζυμικής τροποποίησης παρουσίασε μια ένδειξη μεταβολής της δομής της γλυκάνης η οποία πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Τέλος, στην περίπτωση της αποτοξικοποίησης υγρού αποβλήτου ελαιουργείου, η λακκάση δεν φάνηκε να αποικοδομεί το απόβλητο.	el
heal.abstract	Laccases (benzenediol: oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2) belong to a group of polyphenol oxidases containing multiple coppers in their active site and are used in many biotechnological applications. Interest in laccases is increasing due to the advantages they display as biocatalysts and focuses on the expression of new laccases, the investigation of the structure, properties and their mechanism of action. The purpose of this thesis was the production and characterization of a novel laccase (MtLac2) from the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila. Firstly, the effect of physicochemical factors in heterologous production of Mt Lac2 from the methylotrophic yeast P. pastoris was examined. Optimum concentration of methanol (1% v/v) and copper (0,025 mM) concentration was determined. Optimization of copper concentration increased the production of the enzyme by 125%, while optimization of methanol concentration of 35.5%. Optimal incubation temperature (30 °C) was also determined. Then, the enzyme MtLac2 was purified in order to be biochemically characterized. At first, molecular weight (80 to 110 kDa) and isoelectric point (pI = 4) of the enzyme were determined. After experimental results and bioinformatic data analysis, expression of the enzyme as two protein forms was attributed to different patterns of O-glycosylation. Optimal conditions of MtLac2 action and the stability of the enzyme in different pH and temperature values was tested. The enzyme activity proved to be high in a range of pH 3-4.5, while in basic and neutral pH values the enzyme was inactive. The enzyme showed high activity at 50 °C and a half-life greater than 24 hours, so it can be classified as thermophilic. The action of the enzyme was also tested in the presence of organic solvents and inhibitors, where the MtLac2 showed satisfactory resistance in all compounds tested, whereas the sodium azide appeared to be the strongest inhibitor. The characterization of the enzyme was completed with the specific activity study in a range of phenolic substrates, ABTS and ascorbic acid, as well as with the kinetic study of MtLac2 with ABTS and 2,6-DMP substrates. The results showed that MtLac2 has probably low redox potential as it did not show remarkable activity in the examined substrates. Furthermore, the enzyme showed very different catalytic characteristics than most laccases mainly due to the high activity observed in the oxidation of ascorbic acid. Last but not least MtLac2 was evaluated in various biotechnological applications of industrial interest. The innovative laccase was used in the detoxification of olive mill wastewater (OMW), the enzymatic modification of commercial glucan and in the biosynthesis of sulfuretin. MtLac2 showed best results in organic synthesis, leading to a successful bioconversion, while in the case of enzymatic modification an indication of change was observed in the glucan structure which should be further investigated. Finally, laccase didn’t appear to degrade the olive mill wastewater.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Δέτση, Αναστασία	el
heal.committeeMemberName	Σταθερόπουλος, Μιλτιάδης	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	140 σ.
heal.fullTextAvailability	true