Μελέτη της αποτοξικοποίησης χλωριωμένων οργανικών ρύπων  με μυκητιακούς βιοκαταλύτες θαλάσσιας προέλευσης

Αγραφιώτης, Ανδρέας; Agrafiotis, Andreas

dc.contributor.author	Αγραφιώτης, Ανδρέας	el
dc.contributor.author	Agrafiotis, Andreas	en
dc.date.accessioned	2017-12-20T11:32:24Z
dc.date.available	2017-12-20T11:32:24Z
dc.date.issued	2017-12-20
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/46140
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.14894
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Αποικοδόμηση	el
dc.subject	2,4-διχλωροφαινόλη	el
dc.subject	2,4,5-τριχλωροδιφαινύλιο	el
dc.subject	Απομόνωση ενζύμου	el
dc.subject	Ενεργότητα	el
dc.subject	Biodegradation	en
dc.subject	2,4,5-Trichlorobiphenyl	en
dc.subject	Enzyme isolation	en
dc.subject	2,4-Dichlorophenol	en
dc.subject	Enzyme activity	en
dc.title	Μελέτη της αποτοξικοποίησης χλωριωμένων οργανικών ρύπων με μυκητιακούς βιοκαταλύτες θαλάσσιας προέλευσης	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2017-10-04
heal.abstract	Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη του δυναμικού θαλάσσια προερχόμενων μυκήτων για αποικοδόμηση του 2,4,5-τριχλωροδιφαινύλιου (PCB 29) και της 2,4-διχλωροφαινόλης (2,4-dCP). Στη συνέχεια, έγινε προσπάθεια διαλεύκανσης του μηχανισμού με τον οποίο οι μύκητες αυτοί βιομετατρέπουν τους ρύπους με βάση τους μεταβολίτες που παράγουν καθώς και με τον προσδιορισμό των ενζυμικών ενεργοτήτων που εκφράζουν. Τέλος, πραγματοποιήθηκε απομόνωση ενός ενζύμου που εμπλέκεται στην αποικοδόμηση της 2,4-dCP. Αρχικά πραγματοποιήθηκε διαλογή για την ανάδειξη των αποτελεσματικότερων μικροοργανισμών ως προς την αποικοδόμηση του PCB 29 και της 2,4-dCP σε αντιδράσεις «κυττάρων σε ηρεμία» αρχικής συγκέντρωσης ρύπου 0,97 μM και 1 mM αντίστοιχα. Σε 11 από τα 44 στελέχη που μελετήθηκαν παρατηρήθηκε μείωση της αρχικής συγκέντρωσης του PCB 29 μεγαλύτερη του 90%, ενώ 5 στελέχη κατάφεραν μείωση της συγκέντρωσης της 2,4-dCP μεγαλύτερη του 50% ύστερα από 10 ημέρες. Ακολούθησαν μελέτες με τους αποδοτικότερους μικροοργανισμούς για την διαλεύκανση του μηχανισμού με τον οποίο αυτοί βιομετατρέπουν την 2,4-dCP με βάση τους μεταβολίτες που παράγουν. Τα διάφορα μεταβολικά προϊόντα που ανιχνεύτηκαν από την αποικοδόμηση της 2,4-dCP περιλαμβάνουν τις ενώσεις: υδροξυ-υδροκινόλη, 3,5-διχλωροκατεχόλη, χλωροφαινόλη, τετραϋδροξυβενζόλιο και μαλεϊνικό οξύ. Όλα τα προϊόντα είναι πιο υδρόφιλα ή/και λιγότερο τοξικά από την αρχική ένωση ενώ το μαλεϊνικό οξύ αποτελεί το μόνο προϊόν ανοιχτού δακτυλίου και το οποίο ανιχνεύτηκε μόνο στο στέλεχος MLm-197-S3. Στη συνέχεια έγιναν δοκιμές προσδιορισμού συγκεκριμένων εξωκυτταρικών ενζυμικών ενεργοτήτων, οι οποίες μπορεί να εμπλέκονται στην βιομετατροπή. Οι ενεργότητες που εξετάστηκαν ήταν οι 1,2 και 2,3-διοξυγενάσες της κατεχόλης (1,2-CD και 2,3-CD) και οι αφαλογονάσες. Στα στελέχη που μελετήθηκαν δεν μπόρεσε να μετρηθεί ενεργότητα αφαλογονασών ενώ προσδιορίστηκε πολύ χαμηλή ενεργότητα 2-3-CD (<0,4 Units/mg πρωτεΐνης). Αντίθετα, η ενεργότητα σε 1,2-CD ήταν πιο υψηλή, με το στέλεχος MLm-197-S3 να επιδεικνύει την υψηλότερη δραστικότητα (41,7 Units/mg πρωτεΐνης στις 63 ώρες). iv Ως εκ τούτου, το στέλεχος MLm-197-S3 επιλέχθηκε για την παραγωγή σε μεγάλη κλίμακα και απομόνωση της εξωκυτταρικής ενεργότητας της 1,2-CD. Ο καθαρισμός του ενζύμου πραγματοποιήθηκε σε ένα στάδιο με στήλη χρωματογραφίας ιοντοεναλλαγής (Q-Sepharose) σε pH 6,0. Η έκλουση της πρωτεΐνης από την στήλη έγινε με διάλυμα 1 Μ χλωριούχου νατρίου με ποσοστιαία ανάκτηση ενζυμικής ενεργότητας ίση με 70,7% της αρχικής. Τέλος, η ηλεκτροφόρηση της πρωτεΐνης σε SDS-PAGE έδειξε ότι η πρωτεΐνη ήταν καθαρή και το μοριακό της βάρος περίπου 73 kDa.	el
heal.abstract	The purpose of this diploma thesis was the study of the potential of marine-derived fungi for the biodegradation of 2,4,5-Trichlorobiphenyl (PCB 29) and 2,4-Dichlorophenol (2,4-dCP). In addition, experiments were carried out in order to elucidate the degradation pathway of these pollutants based on the produced metabolites and the expression of enzyme activities. Finally, an enzyme, which participates in the degradation of 2,4-dCP, was purified.. The screening of the fungal strains for the degradation of PCB 29 and 2,4-dCP with initial concentrations of 0,97 μM and 1 mM, respectively, was performed with resting cells reactions. 11 of 44 strains showed more than 90% decrease of the initial concentration of PCB 29, whereas 5 strains managed to transform more than 50% of the initial 2,4-dCP concentration, after 10 days of incubation. For the strains that showed the best potential in the biodegradation of 2,4-dCP, analysis for the identification of metabolites where carried out. The products that were identified include hydroxyquinol, 3,5-dichlorocatechol, chlorophenol, tetrahydroxybenzene and maleylacetate. All products were more hydrophilic or/and less toxic that the starting compound. Strain MLm-197-S3 was the only one found to open the ring of hydroxyquinol and transform it to maleylacetate. In addition, enzyme assays where performed for extracellular enzymes that might participate in the degradation pathway of 2,4-dCP. The enzyme activities that were tested included catechol dioxygenase enzymes (1,2-CD and 2,3-CD) and dehalogenases. The strains tested did not show any dehalogenase activity while 2,3-CD activity was very low (<0,4 Units/mg of protein). On the contrary, high of 1,2-CD activity was measured, with strain MLm-197-S3 showing the highest (41,7 Units/mg of protein at 63 hours of incubation). Thus, strain MLm-197-S3 was selected for the production on a larger scale and the purification of extracellular 1,2-CD enzyme. A single-step purification protocol was used which included a Q-Sepharose column equilibrated with buffer pH 6.0. The protein was eluted from the column with 1 M sodium chloride solution with an enzyme activity recovery equal to 70.7% of the initial. The SDS-PAGE analysis revealed that the enzyme was pure and its molecular weight was approximately 73 kDa.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Χαμηλάκης, Στυλιανός	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	115 σ.	el
heal.fullTextAvailability	true