Μελέτη της βιοτεχνολογικής αξιοποίησης και βιοκαταλυτικής συμπεριφοράς του μικροφύκους Nannochloropsis oceanica

Σαββίδου, Μαρία-Θεογνωσία Γ.

dc.contributor.author	Σαββίδου, Μαρία-Θεογνωσία Γ.	el
dc.date.accessioned	2017-12-21T10:53:54Z
dc.date.available	2017-12-21T10:53:54Z
dc.date.issued	2017-12-21
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/46156
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.2863
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Μικροφύκη	el
dc.subject	Nannochloropsis oceanica	el
dc.subject	Λιπάση	el
dc.subject	Εστεροποίηση/υδρόλυση	el
dc.subject	Ανάπτυξη	el
dc.subject	Λιπίδια	el
dc.subject	Λιπαρά οξέα	el
dc.subject	Microalgae	en
dc.subject	Nannochloropsis oceanica	en
dc.subject	Lipase	en
dc.subject	Esterification/hydrolysis	en
dc.subject	Growth	en
dc.subject	Lipids	en
dc.subject	Fatty acids	en
dc.title	Μελέτη της βιοτεχνολογικής αξιοποίησης και βιοκαταλυτικής συμπεριφοράς του μικροφύκους Nannochloropsis oceanica	el
dc.title	Studies on biotechnological exploitation and biocatalytic behavior of microalgae Nannochloropsis oceanica	en
dc.contributor.department	Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (ΙV) - Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.type	doctoralThesis
heal.classification	Μηχανική & Τεχνολογία	el
heal.classification	Βιομηχανική Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	campus
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2017-11-06
heal.abstract	Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η βιοτεχνολογική αξιοποίηση και η βιοκαταλυτική συμπεριφορά του μικροφύκους Nannochloropsis oceanica CCMP1779. Το μικροφύκος N. oceanica CCMP1779, θεωρείται από τα σημαντικότερα λόγω της χρήσης του στην παραγωγή βιοκαυσίμων, προϊόντων φαρμακευτικού και διατροφικού ενδιαφέροντος καθώς και ως πρόσθετο σε ζωοτροφές και καλλυντικά. Εξετάσθηκε ο ρόλος της αρχικής τιμής του pH της καλλιέργειας (7.4 έως 9.0), της φωτοπεριόδου (24h φως, 16:8h φως:σκότος και 24h σκότος), της σύστασης του θρεπτικού μέσου καλλιέργειας (απομάκρυνση ιόντων Fe3+, Mn2+, ΝO31- και PO3-), της συγκέντρωσης του όξινου ανθρακικού νατρίου (NaHCO3) (0.5 έως 5.0 g L-1) και του νιτρικού νατρίου (NaNO3) (0.0 έως 0.1125 g L-1) καθώς και της συνδυασμένης επίδρασης αυτών, στη παραγωγή βιομάζας και λιπιδίων και στη βιοσύνθεση της χλωροφύλλης και των επιμέρους λιπαρών οξέων. H παραγωγή της βιομάζας και η συσσώρευση των λιπιδίων και της χλωροφύλλης ευνοήθηκαν όταν το μικροφύκος N. oceanica CCMP1779 καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό μέσο με αρχική τιμή pH 8.0. Κατά την καλλιέργεια του μικροφύκους σε συνεχές φως, βρέθηκε ότι η παραγωγή βιομάζας ήταν 1.4 και 1.7 φορές μεγαλύτερη από την αντίστοιχη καλλιέργεια όπου η φωτοπερίοδος ήταν 16:8 h φως:σκότος ή συνεχές σκότος. Το μέγιστο λιπιδικό περιεχόμενο υπολογίσθηκε όταν η φωτοπερίοδος ρυθμίστηκε σε 16:8h φως:σκότος. Επιπλέον, μελετήθηκε ο ρόλος της σύστασης του μέσου καλλιέργειας του μικροφύκους N. oceanica CCMP1779 και διαπιστώθηκε ότι όταν το μικροφύκος N. oceanica CCMP1779 καλλιεργήθηκε στο θρεπτικό μέσο F/2 παρουσία όλων των απαραίτητων συστατικών και βιταμινών, επετεύχθη η υψηλότερη συγκέντρωση βιομάζας. Το λιπιδικό περιεχόμενο βρέθηκε κατά 10% αυξημένο όταν μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό μέσο απουσία του νιτρικού νατρίου. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασε η μελέτη του ρόλου της σύστασης του θρεπτικού μέσου στη συγκομιδή του μικροφύκους N. oceanica CCMP1779 με τη χρήση μαγνητικών σωματιδίων Fe3O4. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υψηλότερη απόδοση συγκομιδής της βιομάζας επετεύχθη όταν εξαιρέθηκε από την καλλιέργεια η κύρια πηγή φωσφόρου (NaH2PO4), ενώ παράλληλα η ίδια συνθήκη οδήγησε σε παραγωγή βιομάζας της τάξης του 92% σε σχέση με τη βιομάζα που προέκυψε όταν ο μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε σε πλήρες θρεπτικό μέσο. Όταν ο μικροοργανισμός N. oceanica CCMP1779 καλλιεργήθηκε υπό αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις όξινου ανθρακικού νατρίου (NaHCO3) (0.5 έως 5.0 g L-1) και σταθερή αρχική συγκέντρωση νιτρικού νατρίου, παρατηρήθηκε ότι ο τετραπλασιασμός της συγκέντρωσης του NaHCO3 (από 0.5 g L‐1 στα 2.0 g L‐1) οδήγησε σε 1.9 φορές μεγαλύτερη συσσώρευση βιομάζας, ενώ το λιπιδικό περιεχόμενο βρέθηκε ίσο με 32.2 % επί της ξηρής βιομάζας. Αντίστοιχα, ο μικροοργανισμός N. oceanica CCMP1779 καλλιεργήθηκε σε αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις νιτρικού νατρίου (NaΝO3) (0.0 έως 0.1125 g L-1) και σταθερή αρχική συγκέντρωση του όξινου ανθρακικού νατρίου. Διαπιστώθηκε ότι η αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης NaΝO3 (από 0 σε 0.1125 g L‐1) οδήγησε σε βελτίωση της παραγωγής βιομάζας κατά 54%. Παρόλα αυτά, το λιπιδικό περιεχόμενο μειώθηκε από 41.6% έως 31.2%, με την αύξηση της συγκέντρωσης NaNO3 από 0 έως 0.1125 g L-1. Το φαινόμενο αυτό υποδηλώνει ότι η έλλειψη του αζώτου επάγει τη συσσώρευση των λιπιδίων στα κύτταρα. Στη συνέχεια, με τη μεθοδολογία της επιφανειακής απόκρισης διερευνήθηκε η συνδυασμένη επίδραση της συγκέντρωσης της πηγής άνθρακα (NaHCO3) και αζώτου (NaΝO3) στην παραγωγή βιομάζας, χλωροφύλλης, λιπιδίων και επί μέρους λιπαρών οξέων. H παραγωγή βιομάζας ευνοήθηκε όταν ο μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε σε αρχικές συγκεντρώσεις NaHCO3 και NaΝO3 ίσες με 2.3 και 0.075 g L-1, αφού παρήχθησαν 0.58 g L‐1 βιομάζας, ενώ η υψηλότερη περιεκτικότητα σε λιπίδια (44.65%) καταγράφηκε σε χαμηλές συγκεντρώσεις της πηγής άνθρακα και αζώτου (0.189 και 0.075 g L-1 αντίστοιχα). Αναφορικά με το προφίλ των λιπαρών οξέων (FAS) του μικροφύκους Ν. oceanica CCMP1779 βρέθηκε ότι κυριαρχείται από κορεσμένα (SFAs) και μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (MUFAs), τα οποία αποτελούν το 88-95% των συνολικών λιπαρών οξέων, ενώ τα πολυακόρεστα λιπαρά (PUFAs) αντιπροσωπεύουν το 5-11%. Η βελτιστοποίηση που προέκυψε βασιζόμενη στο κεντρικό πειραματικό σχεδιασμό έδειξε ότι ο συνδυασμός των 1.3 g L-1 NaHCO3 και 0.06 g L-1 NaNO3 μεγιστοποιεί τη συσσώρευση των λιπαρών οξέων και το περιεχόμενο σε MUFAs, ενώ οδηγεί στην ελάχιστη περιεκτικότητα σε PUFAs και εικοσαπενταενοϊκό οξύ (EPA). Ακολούθησε κλιμάκωση μεγέθους με τη καλλιέργεια του N. oceanica CCMP1779 σε φωτοβιοαντιδραστήρα όγκου 5L όπου η παραγωγή ξηρής βιομάζας βρέθηκε ίση με 1.47 g L-1 . Εξαιτίας της πληθώρας των βιοτεχνολογικών εφαρμογών της ενζυμικής κατάλυσης, η ανάγκη εύρεσης νέων ενζυμικών δράσεων από μικροοργανισμούς κρίνεται απαραίτητη. Έτσι, στα πειραματικά αποτελέσματα συγκαταλέγεται η δυνατότητα αξιοποίησης του μικροοργανισμού σε αντιδράσεις βιοκατάλυσης με την μορφή ολοκλήρων κυττάρων ή κυτταρικών μεμβρανών (αντιδράσεις υδρόλυσης και εστεροποίησης) του μικροφύκους N. oceanica CCMP1779. Αρχικά, προσδιορίστηκε η τοπολογία των ενζυμικών δράσεων. Λιπολυτική δράση προσδιορίστηκε στα ολόκληρα κύτταρα και στις κυτταρικές μεμβράνες του μικροοργανισμού ενώ δεν ανιχνεύτηκε εξωκυτταρικά. Η μέγιστη δραστικότητα του λιπολυτικού ενζύμου εντοπίστηκε στις κυτταρικές μεμβράνες (CDLA) του μικροοργανισμού. Η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης του CDLA βρέθηκε ίση με 50 oC. Όσον αφορά στη τιμή του pH, το CDLA εμφανίστηκε αρκετά σταθερό σε ένα ευρύ φάσμα τιμών και ως βέλτιστη τιμή δράσης ήταν η τιμή 7.0. Επίσης, επέδειξε σταθερότητα παρουσία διαφορετικών οργανικών διαλυτών ενώ διατήρησε υψηλότερη δραστικότητα σε μη-πολικούς διαλύτες και συγκεκριμένα το n-οκτάνιο (71%) μετά από 6 ώρες επώασης. Η επίδραση διαφόρων μεταλλικών ιόντων όπως του μαγγανίου (Mn2+) ενίσχυσε την δραστικότητα κατά 68.25%. Όταν εξετάσθηκε η επίδραση επιφανειοδραστικών ουσιών, προέκυψε ότι η παρουσία της αμφιτεριονικής (CHAPS) και της μη-ιονικής επιφανειοδραστικής ουσίας (Triton Χ-100) παρεμπόδισε τη λιπολυτική δράση του προσδεμένου στη μεμβράνη ενζύμου και παράλληλα δεν κατέστη δυνατή η αποδέσμευσή του από την κυτταρική μεμβράνη. Ολοκληρώνοντας τον χαρακτηρισμό του CDLA, μελετήθηκε η υδρολυτική εξειδίκευση του έναντι εστέρων της παρα-νιτροφαινόλης με λιπαρά οξέα διαφορετικού μήκους ανθρακικής αλυσίδας (C2:0-C16:0) και βρέθηκε η προτίμηση του στον εστέρα της παρα – νιτρο – φαινόλης με παλμιτικό οξύ. Η μέγιστη ταχύτητα της αντίδρασης (vmax) ήταν ίση με 0.138, 0.257 και 0.054 mmole pNP/mg protein/min, αντίστοιχα για τους τρεις εστέρες (pNPC, pNPL, pNPP) και η σταθερά Michaelis-Menten (Km) ίση με 0.352, 0.874 και 0.051 mM. Οι σταθερές παρεμπόδισης (KI) για τους εστέρες της παρα – νιτρο – φαινόλης με λαυρικό και παλμιτικό οξύ βρέθηκαν ίσες με 0.185 και 0.898 mM, αντίστοιχα. Ο προσδιορισμός της λιπολυτικής ικανότητας των ολόκληρων κύτταρων μέσω της αντίδρασης υδρόλυσης σε θερμοκρασία 30οC, έδειξε ότι το ενζυμικό σκεύασμα παρουσίασε μεγαλύτερη εξειδίκευση σε υποστρώματα με μικρού μήκους ανθρακική αλυσίδα (εστέρας της παρα – νιτρο – φαινόλης με βουτυρικό οξύ) και η βελτιστη τιμή δράσης ήταν το pH 7.0. Επίσης εμφάνισε θερμοσταθερότητα σε υψηλές θερμοκρασίες ενώ η κατεργασία του με επιφανειοδραστικές ουσίες (SDS, Triton X-100, CHAPS) προκάλεσε απώλεια της ενζυμικής δραστικότητας. Ακολούθως βρέθηκε ότι η παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων NaCl οδήγησε σε μείωση της λιπολυτικής δράσης κατά 50%. Τέλος, μελετήθηκε η δυνατότητα αξιοποίησης του μικροοργανισμού σε αντιδράσεις εστεροποίησης λιπαρών οξέων με πρωτοταγείς αλκοόλες καταλυόμενες από το CDLA. Μελετήθηκε η συγκέντρωση του ενζυμικού σκευάσματος, η ταχύτητα ανάδευσης της αντίδρασης, η επίδραση της θερμοκρασίας στην αντίδραση καθώς και η επίδραση του μήκους της ανθρακικής αλυσίδας των πρωτοταγών αλκοολών (μεθανόλη, αιθανόλη, n-προπανόλη και n-βουτανόλη). Η αντίδραση εστεροποίησης του παλμιτικού οξέος με την αιθανόλη σε η-οκτάνιο καταλυόμενη από το CDLA φάνηκε να ακολουθεί μηχανισμό πινγκ-πονγκ, χωρίς αναστολή από το υπόστρωμα (εντός της συγκεκριμένης περιοχής συγκεντρώσεων υποστρωμάτων που εξετάσθηκαν). Οι κινητικές σταθερές της αντίδρασης εστεροποίησης βρέθηκαν ίσες με vmax=7.02•10-4 mmol εστέρα/g Ε.Σ./h, Κm,παλμιτικού οξέος=86.96 mM και Κm,αιθανόλης=341.71 mM. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ιδιότητες του προς μελέτη ενζυμικού συστήματος το οποίο βρίσκεται ακινητοποιημένο στις κυτταρικές μεμβράνες, το καθιστούν ένα ενδιαφέρον σύστημα για περαιτέρω διερεύνηση, ενώ για πρώτη φορά πραγματοποιήθηκε μια επιτυχημένη προσπάθεια μελέτης των ενζυμικών δράσεων του μικροφύκους N. oceanica CCMP1779.	el
heal.abstract	The aim of the present work is the biotechnological exploitation and biocatalytic behavior of microalgae Nannochloropsis oceanica CCMP1779. The N. oceanica CCMP1779 is considered to be one of the most important microalgae for industrial use in food products, cosmetics, biofuels and pharmaceuticals. The role of the initial pH of the culture (7.4 to 9.0), the photoperiod (24h light, 16:8h light: dark and 24h dark), the culture medium composition (removal of Fe3+, Mn2+, NO31- and PO3-), the concentration of sodium bicarbonate (NaHCO3) (0.5 to 5.0 g L-1) and the concentration of sodium nitrate (NaNO3) (0.0 to 0.1125 g L-1) and their combined effect were examined on biomass and lipid production as well as on the biosynthesis of chlorophyll and fatty acid’s profile. Biomass production and accumulation of lipids and chlorophyll were favored when N. oceanica CCMP1779 was cultured in culture medium at pH 8.0. During cultivation in continuous light, it was found that biomass production was 1.4 times higher contrary to photoperiod 16:8 h light: dark and 1.7 times higher contrary to 24h dark. The maximum lipid content was observed when the photoperiod was set to 16:8 h light: dark. When the effect of medium composition of N. oceanica CCMP1779 was studied, it was found that the highest biomass concentration was achieved in presence of all the necessary constituents and vitamins of F/2 medium. The lipid content was found to be 10% higher when the culture was depleted in sodium nitrate. Of particular interest was the harvesting of Nannochloropsis oceanica using magnetic separation with naked iron oxide particles. The results showed that the highest separation efficiencies were achieved when the main phosphorus source from the culture medium was excluded, while the same condition led to high biomass production. When N. oceanica CCMP1779 was cultured under increasing initial concentrations of bicarbonate (NaHCO3) (0.5 to 5.0 g L-1) and a constant initial nitrogen concentration, it was observed that quadrupling of the NaHCO3 concentration (from 0.5 g L-1 to 2.0 g L-1) resulted in a 1.9-fold increase in biomass accumulation, while lipid content was found to be 32.2% w/w on dry biomass. Accordingly, the N. oceanica CCMP1779 was cultured under increasing initial concentrations of sodium nitrate (NaNO3) (0.0 to 0.1125 g L-1) and a constant initial concentration of sodium bicarbonate. It was found that increasing the initial concentration of NaNO3 (from 0 to 0.1125 g L-1) resulted in an improvement of 54% of biomass production. However, the lipid content decreased from 41.6% to 31.2%, with the NaNO3 concentration increasing from 0 to 0.1125 g L-1. This phenomenon suggests that nitrogen deficiency induce the accumulation of lipids in cells. Response surface methodology (RSM) was used to evaluate the combined effect of the initial carbon (NaHCO3) and nitrogen (NaNO3) source concentration on the synthesis of biomass, chlorophyll, lipid and fatty acid’s profile by Nannochloropsis oceanica CCMP1779, applying a 22 full-factorial central composite design with four axial points. Highest biomass production (0.581 g L-1) was obtained at high carbon concentration, while low nitrogen concentration favors the lipids accumulation (highest lipid content 44.65 %). The fatty acids (FAs) profile of N. oceanica CCMP1779 was dominated by saturated (SFAs) and monounsaturated fatty acids (MUFAs), comprising 88–95% of the total FAs, while polyunsaturated fatty acids (PUFAs) accounted for 5–11%% of the total FA’s. Optimization of through RSM indicated that a combination of 1.3 g L-1 NaHCO3 and 0.06 g L-1 NaNO3 maximizes the FAs accumulation and MUFAs content, while the above conditions have the exact opposite effect on PUFAs and eicosapentaenoic acid (EPA) content. Scale up of cultivation of N. oceanica CCMP1779 in a 5L volume photobioreactor was attempted, where dry biomass production of 1.47 g L-1 was achieved. Due to the abundance of biotechnological applications of enzyme catalysis, the need of identifying new enzymatic activities of microorganisms is considered important. Thus, the experimental results include the possibility of exploiting the microorganism in biocatalytic reactions in the form of whole cells or cell membranes of N. oceanica CCMP1779 (hydrolysis and esterification reactions). Initially, the localization of lipolytic activities was studied. Lipolytic activity was determined in whole cells and cellular debris of the microorganism while it was not detected extracellularly. The maximum lipolytic activity was found in the cell debris (CDLA) of the microorganism. The enzyme revealed optimal lipolytic activity at 50 ° C and pH 7.0. Also, it exhibited stability in presence of different organic solvents while maintaining higher activity in non-polar solvents, namely n-octane (71%), even after 6 hours of incubation. The effect of various metal ions such as manganese (Mn2+) enhanced the activity by 68.25%. When the effect of surfactants was examined, the presence of a zwitterionic (CHAPS) and a non-ionic (Triton X-100) surfactant prevented the lipolytic activity of the membrane-bound enzyme and its release from the cell membrane. By completing the characterization of the lipolytic enzyme, the hydrolytic specificity of p-nitrophenyl esters of fatty acids of different carbon chain lengths (C2:0-C16:0) was studied and its preference to p-nitrophenyl palmitate was found. The maximal velocity (vmax) was calculated at values 0.138, 0.257 and 0.054 mmole pNP /mg protein/min respectively for the three esters (pNPC, pNPL, pNPP) and the Michaelis-Menten constant (Km) was found to be 0.352, 0.874 and 0.051 mM. The inhibition constants (KI) for p-nitrophenyl laurate and palmitate were found to be equal to 0.185 and 0.898 mM, respectively. The highest whole cell lipase catalytic efficiency was observed against p-nitrophenyl butyrate and the optimum pH for hydrolysis was determined pH 7.0. Treatment with the surfactants SDS, Triton X-100 and CHAPS, which are known to inhibit lipase activity in various degrees, results in a loss of cell bound lipolytic activities. High-salt concentrations (1M NaCl) lead to about 50% whole cell enzyme inhibition. Finally, esterification of hexadecanoic acid with ethanol, catalyzed by the membrane-bound lipolytic enzyme from the microalgae Nannochloropsis oceanica CCMP1779 was studied and a suggestion of a mechanism in order to determine kinetic constants was proposed. The enzyme’s concentration, the speed of agitation, the influence of temperature on the reaction, as well as the effect of the carbon chain length of the primary alcohols (methanol, ethanol, n-propanol and n-butanol) was examined. The kinetics of this synthesis follows a Ping-Pong mechanism. The kinetic constants obtained were vmax =7.02 x 10-4 mmol ester/g E/h, Km (palmitic acid) = 86.96 mM and Km (ethanol) = 341.71 mM. Results showed that the properties of the membrane-bound lipolytic enzyme of N. oceanica CCMP1779 make it an interesting system for further investigation.	en
heal.advisorName	Κολίσης, Φραγκίσκος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Σωτηρούδης, Θεόδωρος	el
heal.committeeMemberName	Μαγουλάς, Κωνσταντίνος	el
heal.committeeMemberName	Σταμάτης, Χαράλαμπος	el
heal.committeeMemberName	Χατζηνικολάου, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.academicPublisher	Σχολή Χημικών Μηχανικών	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	264 σ., εικ., πιν., σχημ.
heal.fullTextAvailability	true