Απομόνωση και βιοχημικός χαρακτηρισμός θερμοανθεκτικής εστεράσης για βιομηχανικές βιοκαταλυτικές εφαρμογές

Σιέττου, Φραντζέσκα; Siettou, Frantzeska

dc.contributor.author	Σιέττου, Φραντζέσκα	el
dc.contributor.author	Siettou, Frantzeska	en
dc.date.accessioned	2018-01-17T13:15:15Z
dc.date.available	2018-01-17T13:15:15Z
dc.date.issued	2018-01-17
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/46220
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.14726
dc.rights	Default License
dc.subject	Ένζυμα	el
dc.subject	Θερμοανθεκτικότητα	el
dc.subject	Εστερολυτικότητα	el
dc.subject	Παραγωγή	el
dc.subject	Χαρακτηρισμός	el
dc.title	Απομόνωση και βιοχημικός χαρακτηρισμός θερμοανθεκτικής εστεράσης για βιομηχανικές βιοκαταλυτικές εφαρμογές	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία μικροοργανισμών	el
heal.classificationURI	http://data.seab.gr/concepts/523dbca59ed539b76aeb249f2bb99717e146c4d5
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2017-10-04
heal.abstract	Η παρούσα διπλωματική εργασία αφορά την ανακάλυψη και το χαρακτηρισμό ενός νέου θερμοανθεκτικού ενζύμου με εστερολυτική δράση. Η γονιδιακή αλληλουχία που κωδικοποιεί το νέο ένζυμο προέκυψε μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης ενός μεταγονιδιωματικού δείγματος από θερμοπηγή της Ισλανδίας, με χρήση του προγράμματος ANASTASIA, το όποιο αναπτύχθηκε στο πλαίσιο του Ευρωπαϊκού ερευνητικού προγράμματος Hotzyme. Πρόκειται για ένα σύστημα το οποίο αποσκοπεί στην αποθήκευση, διαχείριση και ανάλυση μεταγονιδιωματικών δεδομένων που έχουν ληφθεί από θερμά περιβάλλοντα. Η εκπόνηση της εργασίας περιλαμβάνει την απομόνωση, τον έλεγχο της ενζυμικής συμπεριφοράς καθώς επίσης και τον βιοχημικό χαρακτηρισμό μιας νέας εστεράσης, την οποία ονομάσαμε EstDZ4, η οποία παρουσιάζει χαμηλή ομολογία με ήδη χαρακτηρισμένες πρωτεϊνες (23% με την Extracellural lipase At5q55050 της κατηγορίας των GDSL). Το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης που κωδικοποιεί την EstDZ4 επιλέχθηκε προς μελέτη, λόγω της υψηλής ομοιότητας (99%) με μια υποθετική πρωτεϊνη που φέρει τα χαρακτηριστικά των GDSL εστερασών και έχει εντοπιστεί σαν αλληλουχία στο γονιδίωμα του βακτηριακού στελέχους Thiomonas sp . Η απομόνωση της αλληλουχίας διενεργήθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) από το μεταγονιδιωματικό δείγμα DNA, το γονίδιο εκφράστηκε ετερόλογα σε βακτηριακά κύτταρα E.coli και απομονώθηκε η πρωτεϊνη που κωδικοποιεί. Η βιοπληροφορική μελέτη της νέας αλληλουχίας έδειξε ότι πρόκειται για μια GDSL εστεράση στο αμινοτελικό άκρο της οποίας περιέχεται ένα πεπτιδίο οδηγος το οποίο και αφαιρέθηκε. Η αφαίρεση του πεπτιδίου οδηγού αύξησε σημαντικά τα επίπεδα παραγωγής του ενζύμου στον ξενιστή οργανισμό και κατέστησε εφικτή την απομόνωση του σε υψηλό βαθμό καθαρότητας, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της χρωματογραφίας συγγένειας ακινητιποιημένου μετάλλου (ΙΜΑC) και της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης (SEC).Το ένζυμο ελέγχθηκε ως προς την εστερολύτική του δράση η οποία και επαληθεύτηκε. Τέλος, πραγματοποιήθηκε και βιοχημικός χαρακτηρισμός της εστεράσης EstDZ4 όπου προσδιορίστηκαν τα βασικά βιοχημικά χαρακτηριστικά του νέου ενζύμου . Η EstDZ4 είναι μια εστεράση που παρουσίαζει εκλεκτικότητα σε υποστρώματα μεσαίου μήκους ανθρακικής αλυσίδας με βέλτιστο το υπόστρωμα του εστέρα της παρανιτροφαινόλης με το καπριλικό οξύ (pnp-octanoate), όπως έδειξαν τα αποτελέσμτα της υδρόλυσης υποστρωμάτων εστέρων της παρανιτροφαινόλης με διαφορετικού μήκους ανθρακικής αλυσίδας λιπαρά οξέα. Η υδρόλυση αυτών των υποστρωμάτων που καταλύεται από την εστεράση EstDZ4 ακολουθεί το κινητικό μοντέλο Michaelis–Menten, εμφανίζοντας την υψηλότερη τιμή καταλυτικής απόδοσης kcat/ KM = 13.467 s-1*mM-1 για το υπόστρωμα του εστέρα της παρανιτροφαινόλης με το καπριλικό οξύ,. Τέλος, η εστεράση EstDZ4 παρουσιάζει βέλτιστη θερμοκρασία λειτουργίας τους 75ο C με χρόνο ημιζωής περίπου 6 h στην ίδια θερμοκρασία, και βέλτιστο pH δράσης 6,5, κάτι που την καθιστά ένα θερμοσταθερό εστερολυτικό ένζυμο.	el
heal.abstract	This particular assignment concerns the detection and characterization of a new thermostable enzyme with esterolytic activity. The DNA sequence, which encodes the novel enzyme, came up from bioinformatics analysis of a metagenomic sample taken from a hot spring in Iceland, using the final form of the program ANASTASIA, which was developed in the framework of the European research program HotZyme. It is about a project whose aim is to store, handle and analyze metagenomic sequencing data which were taken from hot springs. The elaboration of this assignment includes the isolation, the inspection of enzymic activity, as well as, the biochemical charectarization of a new esterase called EstDZ4 esterase, which presents low homology in already characterized proteins (23% with Extracellurallipase At 5q55050 of GDSL family). The open reading frame, which encodes EstDZ4, was selected for extensive research due to a moderate similarity 99%), with a hypothetical protein which has the characteristics of GDSL esterases and was found as DNA sequence in the genome of the bacterial strain Thiomonas sp. The isolation of the sequence was conducted with Polymerase Chain Reaction (PCR) from the metagenomic DNA sample, this DNA sequence was expressed in E. coli and the protein encoded, was isolated. The bioinformatics research of the new sequence showed that it is about a GDSL esterase whose N-terminus signal sequence was discovered and removed. The removal of the signal sequence increased the production leves significantly and facilitated the purification of the enzyme using immobilized metal ion affinity (IMAC) and size exclusion chromatography (SEC). The enzyme was confirmed to have esterolytic activity. Finally, a biochemical characterization of EstDZ4 was performed, where the basic biochemical characteristics of the new enzyme were determined. EstDZ4 is an esterase, which shows selectivity in medium carbon chain substrates and identically in pnp-octanoate, based on the results of the hydrolysis of aranitrophenol ester substrates with diferrent carbon chain fatty acids.The hydrolysis of EstDZ4 follows the Michaelis-Menten kinetic model and exhibits the highest catalytic yield value kcat/ KM=13,467s-1 * mM-1 for the paranitrophenol ester substrate with caprylic acid. Finally, esterase EstDZ4 presents optimal operation temperature of 75οC with half life of approximately 6h at the same temperature, and optimal pH 6.5, which facilitated ΕstDZ4 a thermostable esterolytic enzyme.	en
heal.advisorName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Παπαδόπουλος, Γεώργιος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας & Εργαστήριο Ενζυμικής και Συνθετικής Βιοτεχνολογίας του Ινστιτούτου Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	81 σ.
heal.fullTextAvailability	true