Μελέτη της επιδιόρθωσης βλαβών DNA από ιοντίζουσα ακτινοβολία με ανάλυση εστιών γH2AX σε εικόνες ανοσοφθορισμού

Φραγκούλης, Γεώργιος; Fragkoulis, Georgios

dc.contributor.author	Φραγκούλης, Γεώργιος	el
dc.contributor.author	Fragkoulis, Georgios	en
dc.date.accessioned	2018-02-15T11:12:53Z
dc.date.available	2018-02-15T11:12:53Z
dc.date.issued	2018-02-15
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/46516
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.14805
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	DNA repair	en
dc.subject	γH2AX foci	en
dc.subject	Lonizing radiation	en
dc.subject	DNA damage	en
dc.subject	Immunofluorescence microscopy	en
dc.subject	Βλάβες DNA	el
dc.subject	Επιδιόρθωση DNA	el
dc.subject	Εστίες γH2AX	el
dc.subject	Ιοντίζουσα ακτινοβολία	el
dc.subject	Μικροσκοπία ανοσοφθορισμού	el
dc.title	Μελέτη της επιδιόρθωσης βλαβών DNA από ιοντίζουσα ακτινοβολία με ανάλυση εστιών γH2AX σε εικόνες ανοσοφθορισμού	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοφυσική και ιατρική φυσική	el
heal.classificationURI	http://data.seab.gr/concepts/b58a5db672dcbfe713694ce50ea555dbe4680c37
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2017-10-16
heal.abstract	Η ιοντίζουσα ακτινοβολία προκαλεί πλήθος διαφορετικών βλαβών στο DNA των κυττάρων. Οι ομαδοποιημένες βλάβες (πολλές βλάβες κοντά μεταξύ τους στην αλληλουχία του DNA) και οι δίκλωνες θραύσεις είναι πιο επικίνδυνες, γιατί οι μηχανισμοί επιδιόρθωσης δυσκολεύονται να τις επεξεργαστούν περισσότερο από τις μεμονωμένες αλλοιώσεις. Όσο πιο πυκνές είναι οι ομαδοποιημένες βλάβες τόσο πιο δύσκολα επιδιορθώνονται και μπορούν να οδηγήσουν με τη σειρά τους σε δίκλωνες θραύσεις. Οι δίκλωνες θραύσεις μπορούν να εντοπιστούν με τη φωσφορυλίωση της ιστόνης H2AX (γΗ2ΑΧ), η οποία εμφανίζεται γρήγορα σε μία μεγάλη περιοχή της χρωματίνης μετά από δίκλωνη θραύση γύρω από τη βλάβη και είναι βασική για την αποτελεσματικότητα της επιδιόρθωσης. Όταν η δίκλωνη θραύση επιδιορθωθεί αποφωσφορυλιώνονται σταδιακά. Οι περιοχές αυτές μπορούν να οπτικοποιηθούν μέσω της μικροσκοπίας ανοσοφθορισμού ώστε να εκτιμηθεί ο αριθμός των δίκλωνων θραύσεων. Ονομάζονται εστίες γΗ2ΑΧ και για μεγάλο εύρος δόσεων ο αριθμός τους ισούται με τον αριθμό των δίκλωνων θραύσεων στον πυρήνα. Η επαγωγή των εστιών γΗ2ΑΧ και η εξέλιξή τους αντικατοπτρίζουν την επαγωγή δίκλωνων θραύσεων και την επιδιόρθωσή τους. Στο πλαίσιο της εργασίας γίνεται μία εισαγωγή στην απόκριση του κυττάρου στην βλάβη DNA και τον ρόλο της γΗ2ΑΧ σε αυτήν και ως βιοδείκτη. Ακόμη μελετήθηκε η επιδιόρθωση των δίκλωνων θραύσεων σε λεμφοκύτταρα για δόσεις 1Gy και 2Gy ακτίνων-γ (60Co) μέσα από ανάλυση εικόνων ανοσοφθορισμού με το λογισμικό JCount. Σκοπός ήταν, αρχικά, να μετρηθούν οι διαφορές στην επαγωγή εστιών γΗ2ΑΧ μεταξύ ακτινοβολημένων και μη κυττάρων σε διαφορετικούς χρόνους μετά την ακτινοβόληση. Παρατηρήθηκε επαναφορά του αριθμού των εστιών στα επίπεδα ελέγχου μετά τις 6 ώρες, ενώ νωρίτερα οι δύο δόσεις μπορούν να διακριθούν. Ακόμη δοκιμάστηκαν δύο μέθοδοι στατιστικής ανάλυσης σε ήδη υπάρχοντα δεδομένα για τον προσδιορισμό του αριθμού των εστιών γΗ2ΑΧ σε σχέση με τη φάση του κυτταρικού κύκλου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μαστού MCF7 (ακτίνες-γ) και αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα A549 (ακτίνες-Χ). Η μία μέθοδος δοκιμάζει την προσαρμογή 4 διαφορετικών κατανομών με δύο κορυφές στο ιστόγραμμα συχνοτήτων των εστιών γΗ2ΑΧ ανά κύτταρο για να βρεθεί η μέση τιμή τους στις φάσεις G0/G1 (πρώτη κορυφή) και G2 (δεύτερη κορυφή). Προτείνονται κριτήρια για την επιλογή των κατάλληλων κατανομών και χρησιμοποιούνται. Για τα MCF7 προκύπτει σχέση ανάμεσα στον αριθμό εστιών και τη δόση #OfFoci=16,77D+0,52. Η δεύτερη μέθοδος χρησιμοποιεί κατανομή με δύο κορυφές στο ιστόγραμμα της συνολικής έντασης στο DAPI για τον εντοπισμό κυττάρων που βρίσκονται σε αυτές τις φάσεις. Προτείνονται κριτήρια για την επιλογή των πυρήνων βάσει της ένταση στο DAPI στα κύτταρα Α549 και ακολουθεί η στατιστική ανάλυση σε αυτό τον πληθυσμό. Τα ακτινοβολημένα διακρίνονται από τα μη ακτινοβολημένα με τη χρήση της Poisson και με την απλή στατιστική ανάλυση για χρόνους μικρότερους από 8 ώρες.	el
heal.abstract	Ionizing Radiation ( IR ) induces a great number of different types of damage to the cellular DNA . Clustered lesions ( many lesions in close proximity in the DNAsequence) and Double Strand Breaks (DSB) are the most deleterious for the cell because the repair mechanisms have a greater difficulty proces sing them than single lesions. The higher the complexity of the lesions , the higher the repair difficulty. Clustered lesions can also lead to DSBs . DSBs can be detected thanks to the phosphorylation of the histone H 2 AX ( γ H 2 AX ), which occurs rapidly in a large region of the chromatin around the DSB and has an important role in the repair efficiency . After the repair of the DSB they are dephosphorated gradually. These regions can be visualized by immunofluorescence microscopy to evaluate the number of DSBs. They are called γ H2AX foci and for a wide range of doses their number are equal to the number of DSB in the nucleus. The induction of γ H 2 AX foci and their progress reflect the induction of DSBs and the progress of their repair . In this thesis there is an introduction in the cellular DNA damage response and in the role of γ H2AX during repair and as a biomarker. The repair of DSBs was also investigated in human lymphocytes after irradiation dosage of 1Gy and 2Gy of γ - rays ( 60 Co ) with immunofluorescence images analysis using the JCount software. Initially , the purpose was to evaluate the difference in γ H 2 AX foci induction between irradiated and non - irradiated cells in different time points after irradiation. Restoration of the number of foci to the control ( non - irradiated ) cell levels 6 hours after irradiation was observed, while before that the doses can be discriminated. Also , two methods of statistical analysis were developed for analyzing existing experimental data to calculate the number of γ H2AX foci depending on the phase of the cell cyrcle. They were used on experiments of human breast cancer li ne MCF 7 ( γ - rays ) and lung adenocarcinoma A549 (X - rays) . In the first method 4 bimodal distributions ( two peaks ) were tried for fitting on the histogram of γΗ 2 ΑΧ foci per c ell to calculate their mean for the G0/G1 phases (first peak) and G2 phase (second peak). A set of criteria were proposed for the choice of suitable distributions. For MCF7 cells we find a linear correlation between the number of foci and dose: # OfFoci = 16, 77 D+0,52 . The second method uses a Bimodal Gaussian distribution on the histogram of the total DAPI intensity of the nucleus to find the Α 549 cells in either of those phases. A set of criteria was proposed for the choice of the cells in G0/G1 phases or G2 phase, an d statistical analysis was afterwards performed on that population , leading to discrimination between the irradiated cells from the non - irradia ted A549 cells for time points below 8 hours, using either simple statistical analysis or the Poisson distribution	en
heal.advisorName	Γεωργακίλας, Αλέξανδρος	el
heal.committeeMemberName	Τερζούδη, Γεωργία	el
heal.committeeMemberName	Κυρίτσης, Απόστολος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Εφαρμοσμένων Μαθηματικών και Φυσικών Επιστημών. Τομέας Ανθρωπιστικών Κοινωνικών Επιστημών και Δικαίου	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	131 σ.
heal.fullTextAvailability	true