Μελέτη της αντίδρασης Maillard Ασπαραγίνης – Σακχάρων σε υψηλές θερμοκρασίες και της προκατεργασίας

Abstract

Η αντίδραση Maillard είναι ένας πολύπλοκος μηχανισμός αντιδράσεων που συμβαίνει στα τρόφιμα κατά τη θερμική κατεργασία τους και έχει σαν αποτέλεσμα την εμφάνιση επιθυμητών οργανοληπτικών χαρακτηριστικών όπως καστανού χρώματος, χαρακτηριστικής γεύσης και αρώματος. Πραγματοποιείται μεταξύ καρβονυλοενώσεων με αμινομάδες και έχει σαν αποτέλεσμα τη δημιουργία σκουρόχρωμων προϊόντων, γνωστών και ως μελανοϊδίνες. Έχει αποδειχθεί ότι ένα από τα προϊόντα της αντίδρασης Maillard είναι και το ακρυλαμίδιο μέσω της αντίδρασης κυρίως της ασπαραγίνης με ανάγοντα σάκχαρα. Το ακρυλαμίδιο όμως, συνιστά μια τοξική ένωση και μάλιστα θεωρείται ένας πιθανός καρκινογόνος παράγοντας σύμφωνα με τη διεθνή αντιπροσωπεία για την έρευνα κατά του καρκίνου (IARC). Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η αντίδραση Maillard ασπαραγίνης – φρουκτόζης σε υψηλές θερμοκρασίες και η προ-κατεργασία με ασπαραγινάση ως μεθόδου ελέγχου του ακρυλαμιδίου. Το ένζυμο ασπαραγινάση υδρολύει την ασπαραγίνη, μία από τις κυριότερες πρόδρομες ουσίες σχηματισμού του ακρυλαμιδίου, προς ασπαρτικό οξύ και αμμωνία. Μελετήθηκε ένα σύστημα ισομοριακού διαλύματoς ασπαραγίνης - φρουκτόζης 0,1 M σε θερμοκρασίες από 140 έως 200 oC και χρόνους από 0 έως 64 min, με και χωρίς προσθήκη του ενζύμου σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις, 3, 15 και 30 U/g ασπαραγίνης. Το σύστημα μοντέλο υποβλήθηκε σε επεξεργασία κάτω από τις ίδιες συνθήκες, αφού πρώτα τα δείγματα που περιείχαν το ένζυμο επωάστηκαν στους 40 oC για 20 min. Προσδιορίστηκαν η περιεκτικότητα σε ασπαραγίνη (kit προσδιορισμού ασπαραγίνης) και φρουκτόζη (μεθοδολογία υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης, HPLC), η περιεκτικότητα σε μελανοϊδίνες (φασματοφωτομετρία), καθώς και το χρώμα (χρωματόμετρο, κλίμακα CIE Lab) και το pH. Διαπιστώθηκε ότι η επίδραση του ενζύμου στη μείωση της ασπαραγίνης ήταν πολύ σημαντική αφού ακόμη και στην περίπτωση της χαμηλής συγκέντρωσης (3 U/g ασπαραγίνης) η μείωση της ασπαραγίνης έφτασε το 72 %. Για τις μεγαλύτερες συγκεντρώσεις η ελάττωση αυτή έφτασε μέχρι 90 %. Η συγκέντρωση της ασπαραγίνης και της φρουκτόζης για το σύστημα ασπαραγίνης – φρουκτόζης (χωρίς την προσθήκη ενζύμου) μειώθηκε με το χρόνο. Τα πειραματικά δεδομένα προσαρμόστηκαν σε μαθηματική εξίσωση μέσω της οποίας υπολογίστηκαν οι ρυθμοί μείωσης, kAsn και kFru (Εξίσωση 3.1 και 3.4). Σημαντική επίδραση είχε η αύξηση της θερμοκρασίας στο ρυθμό κατανάλωσης και στα δύο συστήματα ασπαραγίνης – φρουκτόζης, με και χωρίς την προσθήκη του ενζύμου. Υπολογίστηκε η ενέργεια ενεργοποίησης για τη μείωση της ασπαραγίνης και της φρουκτόζης σε 66,8 και 77,4 kJ∙mol-1, αντίστοιχα. Όσον αφορά στις υπόλοιπες ιδιότητες του συστήματος αυτές δεν επηρεάστηκαν από την προσθήκη του ενζύμου. Το χρώμα (δείκτες χρώματος L και DE), το pH και η περιεκτικότητα των μελανοϊδινών δεν παρουσίασαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο συστημάτων ασπαραγίνης και φρουκτόζης. Για την αύξηση της περιεκτικότητας των μελανοϊδινών, βρέθηκε ότι η αντίδραση ακολουθεί κινητική τάξης n=0,5 (R2= 0,914). Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα, η χρήση του ενζύμου επιφέρει σημαντική μείωση στην περιεχόμενη ασπαραγίνη του συστήματος ασπαραγίνης φρουκτόζης που μελετήθηκε, χωρίς όμως να επηρεάζει την περιεκτικότητα των μελανοϊδινών, το χρώμα και το pΗ. Αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το ένζυμο μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε πραγματικά τρόφιμα χωρίς να μεταβάλλει τα οργανοληπτικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τους. Σύμφωνα με βιβλιογραφικές αναφορές η χρήση του ενζύμου προκαλεί μείωση στο σχηματιζόμενο ακρυλαμίδιο μέσω της αντίδρασης ασπαραγίνης και φρουκτόζης. Συγκεκριμένα, η προσθήκη του ενζύμου μπορεί να επιφέρει μείωση ως και 96 % του σχηματιζόμενου ακρυλαμιδίου.

Acrylamide is formed as a side-product of Maillard reaction between asparagine and carbohydrates in heat-treated foods. Different approaches to decrease acrylamide content in foods have been applied, including enzymes and antioxidant agents. Pretreatment with the enzyme L-asparaginase has been proposed to reduce acrylamide content, since L-asparagine is considered to be one of the main precursors.

The aim was to study conditions for the effective application of L-asparaginase for mitigation of acrylamide formation in a fructose(Fru)/asparagine(Asn) model system.

Fru/Asn solutions of molar ratio, 0.1:0.1, were prepared in phosphate buffer, set to have pH 6 and heated at 140-200ºC. Asparaginase solution (3154.6ASNU/g. Acrylaway, Novozymes) was used for enzyme pretreatment of samples in concentrations 0.2-2.0ASNU/g of sample for 10-60min at 37-60°C. The concentration of fructose and asparagine was measured, as well as the extent of browning (melanoidine concentration) after heating.

During heating of Fru/Asn, the concentration of reactants decreased as a function of time; the concentration of melanoidins increased. The reaction rate showed a maximum for pH=7.3, and increased with temperature. Temperature dependence was modeled by the Arrhenius equation (Ea=63-89kJ/mol showing an exponential decrease with pH). The reaction rate also depended on the initial molar ratio of the reactants increasing at higher Fru ratios. 90% reduction of asparagine was achieved at enzyme concentration of 2.0ASNU/g and incubation at 37°C for 30min. A comprehensive mathematical model predicting the temperature, pH and reactant concentrations’ effects on browning was developed. Good agreement between predicted and experimental rates from independent experiments was observed. The application of L-asparaginase was confirmed to be effective in asparagine reduction in Maillard model system. Asparagine reduction was well correlated to acrylamide reduction at all temperatures in 150-200°C range.

Feasibility of asparagine reduction, through enzyme pretreatment opens new perspectives for many asparagine containing foods for affecting acrylamide reduction.

Acrylamide is formed as a side-product of Maillard reaction between asparagine and carbohydrates in heat-treated foods. Different approaches to decrease acrylamide content in foods have been applied, including enzymes and antioxidant agents. Pretreatment with the enzyme L-asparaginase has been proposed to reduce acrylamide content, since L-asparagine is considered to be one of the main precursors. Feasibility of asparagine reduction, through L-asparaginase pretreatment opens new perspectives for many asparagine containing foods for affecting acrylamide reduction.