Χαρακτηρισμός καινοτόμων εστερασών της ημικυτταρίνης με μοντέλα υποστρώματα

Γκούτης, Αντώνιος; Gkoutis, Antonios

dc.contributor.author	Γκούτης, Αντώνιος	el
dc.contributor.author	Gkoutis, Antonios	en
dc.date.accessioned	2019-03-01T08:58:59Z
dc.date.available	2019-03-01T08:58:59Z
dc.date.issued	2019-03-01
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/48332
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.16332
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Εστεράσες γλυκουρονικού οξέος	el
dc.subject	Trametes ljubarskyi	en
dc.subject	Artolenzites elegans	en
dc.subject	Φυτική βιομάζα	el
dc.subject	Γλυκουρονικό οξύ	el
dc.subject	Biomass degradation	en
dc.subject	Cinnamyl alcohol	en
dc.subject	Cinnamyl alcohol phenylester	en
dc.subject	Μελέτη κινητικών παραμέτρων	el
dc.subject	Ενζυμική ενεργότητα	el
dc.title	Χαρακτηρισμός καινοτόμων εστερασών της ημικυτταρίνης με μοντέλα υποστρώματα	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Χημική τεχνολογία και μηχανική	el
heal.classificationURI	http://data.seab.gr/concepts/17d26c7ad4b1baa3e1976533f499eef793ef5338
heal.classificationURI	http://data.seab.gr/concepts/26ef8a85171bd6096109bf5b78a055756bca69b8
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2018-09-29
heal.abstract	Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η παραγωγή και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός δύο καινοτόμων εστερασών του γλυκουρονικού οξέος από τους βασιδιομύκητες Artolenzites elegans και Trametes ljubarskyi στο συνθετικό φαινυλεστέρα της κινναμικής αλκοόλης με D-γλυκουρονικό οξύ. Αρχικά τα γονίδια των γλυκουρονικών εστερασών AeGE15 και TlGE15 εκφράστηκαν, παρήχθησαν και απομονώθηκαν μέσω του συστήματος ετερόλογης έκφρασης της μεθυλότροφης ζύμης Pichia pastoris X33. Η παραγωγή έλαβε χώρα σε υγρές καλλιέργειες των κυττάρων της ζύμης, η απομόνωση έγινε με στάδια διηθήσεων, συμπύκνωσης και χρωματογραφίας συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου (IMAC), τα μοριακά βάρη των δύο ενζύμων προσδιορίστηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και τα ισοηλεκτρικά τους σημεία μέσω ηλεκτροφόρησης ισοηλεκτρικής εστίασης σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (IEF-PAGE). Ακολούθησε ενζυμική σύνθεση και καθαρισμός ενός συνθετικού, ανάλογου των φυσικών, υποστρώματος: του εστέρα της κινναμικής αλκοόλης με D-γλυκουρονικό οξύ. Ως βιοκαταλύτης χρησιμοποιήθηκε η λιπάση Novozym 435 και ο καθαρισμός έγινε με εκχύλιση και χρωματογραφία πηκτής διοξειδίου του πυριτίου (TLC). Στη συνέχεια έλαβε χώρα βιοχημικός χαρακτηρισμός και κινητική μελέτη των δύο εστερασών στο συνθετικό υπόστρωμα. Υπολογίστηκαν οι σταθερές Michaelis-Menten Km και kcat, όπως επίσης και ο λόγος kcat / Km ο οποίος αποτελεί ένδειξη για την προτίμηση του ενζύμου ως προς το υπόστρωμα. Ο υπολογισμός πραγματοποιήθηκε με ποσοτικό προσδιορισμό της απελευθέρωσης της κινναμικής αλκοόλης κατά την υδρόλυση του υποστρώματος από τις AeGE15 και TlGE15 με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Πρόκειται για την πρώτη μελέτη της δράσης των συγκεκριμένων καινοτόμων γλυκουρονικών εστερασών και μια εκ των πρώτων μελετών όπου χρησιμοποιήθηκε φαινολικός εστέρας του D-γλυκουρονικού οξέος, συμβάλλοντας στην προσπάθεια διαλεύκανσης του ρόλου των εστερασών του γλυκουρονικού οξέος στην αποικοδόμηση του κυτταρικού τοιχώματος των φυτών.	el
heal.abstract	The present diploma thesis examines the production, biochemical characterization and action of two novel glucuronyl esterases from the basidiomycetes A. elegans and T. ljubarskyi on the synthetic phenyl ester of D-glucuronic acid with cinammyl alcohol. Initially the genes of the glucuronyl esterases AeGE15 and TlGE15 were expressed, produced and isolated by the heterologous expression system of the transformed methylotrophic yeast P.pastoris X33. For the purification of the recombinant proteins, culture broth was centrifuged, filtrated and concentrated and subsequently the proteins were purified using immobilized metal-ion affinity chromatography (IMAC). Both the homogeneity and the molecular weight of the purified proteins were assessed by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) and their isoelectric points by Isoelectric Focusing-PAGE (IEF-PAGE). Enzymatic synthesis and purification of Cinnamyl alcohol ester with D-glucuronic acid followed. This synthetic substrate mimics the ester linkages of natural ones. Novozym 435 immobilized Candida antarctica Lipase B was used in organic medium. The glucuronate, containing a UV-absorbing chromophore, was purified by filtration, extraction and silica gel chromatography (TLC). Biochemical characterization and kinetic study of the two esterases on the synthetic substrate was then performed. The Michaelis-Menten Km and kcat constants, as well as the kcat / Km ratio, which is indicative of the enzyme's preference for the substrate, were calculated. The determination of kinetic parameters was carried out by using a quantitative assay which was based on the measurement of the increase of cinnamyl alcohol during hydrolysis of the substrate by the esterases AeGE15 and TIEG15 and detected by high performance liquid chromatography (HPLC). This is the first study on the action of these two novel glucuronate esterases and one of the first studies to use phenylester of D-glucuronic acid in an attempt elucidate the role of glucuronic acid esterases in the cell wall degradation process.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Καλογήρου, Ιωάννης	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	89 σ.
heal.fullTextAvailability	true