Αξιοποίηση ενζυμικού συστήματος βασιδιομυκήτων σε εφαρμογές βιοαποικοδόμησης

Πεντάρη, Χριστίνα; Pentari, Christina

dc.contributor.author	Πεντάρη, Χριστίνα	el
dc.contributor.author	Pentari, Christina	en
dc.date.accessioned	2019-03-28T12:01:29Z
dc.date.available	2019-03-28T12:01:29Z
dc.date.issued	2019-03-28
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/48529
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.16535
dc.rights	Default License
dc.subject	Λακκάση	el
dc.subject	Βασιδιομύκητες	el
dc.subject	Βιοαποικοδόμηση	el
dc.subject	Υγρά απόβλητα ελαιουργείου	el
dc.subject	Οργανική σύνθεση	el
dc.subject	Laccase	en
dc.subject	Basidiomycetes	en
dc.subject	Biodegradation	en
dc.subject	Oil mill wastewater	en
dc.subject	Organic synthesis	en
dc.title	Αξιοποίηση ενζυμικού συστήματος βασιδιομυκήτων σε εφαρμογές βιοαποικοδόμησης	el
dc.title	Utilization of the enzymatic system of basidiomycetes in biodegradation applications	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Χημική μηχανική	el
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Chemical engineering	en
heal.classification	Biotechnology	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2018-10-04
heal.abstract	Οι λακκάσες αποτελούν οξειδοαναγωγικά ένζυμα, που συναντώνται στο λιγνινολυτικό ενζυμικό σύστημα των Βασιδιομυκήτων, με σημαντικές προοπτικές αξιοποίησης σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές, όπως το κομμάτι κατεργασίας και αξιοποίησης λιγνοκυταρινούχου βιομάζας. Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε το ενζυμικό λιγνινολυτικό σύστημα του Βασιδιομύκητα λευκής σήψης Pleurotus citrinopileatus. Πραγματοποιήθηκαν βιοχημικός χαρακτηρισμός των καθαρών λακκασών PcLac1 και PcLac2 του μύκητα και ακινητοποίηση των ενζύμων του υπερκείμενου της καλλιέργειάς του και τέλος εξετάστηκαν βιοτεχνολογικές εφαρμογές των ενζυμικών παρασκευασμάτων. Οι λακκάσες PcLac1 και PcLac2, με μοριακά βάρη 40 και 80 kDa και φαινόμενα πρότυπα οξειδοαναγωγικά δυναμικά 250 και 200 mV αντίστοιχα, παρουσιάζουν χαρακτηριστικές απορροφήσεις γύρω στα 330 nm, με την PcLac1 να έχει απορρόφηση και στα 610 nm, ενώ η PcLac1 έχει ισοηλεκτρικό σημείο pI 3,5. Οι βέλτιστες συνθήκες δράσης είναι σε pH 4,5 και 55⁰C για την PcLac1 και σε pH 4 και 55⁰C για την PcLac2, βάσει μετρήσεων με ABTS. Οι δύο λακκάσες οξειδώνουν υδροβενζόλες και υδροξικιναμικά οξέα, με την PcLac1 να παρουσιάζει ενεργότητα 0,08 U/mg για την 2,6-DMP και την υδροκινόνη ενώ η PcLac2 έχει 0,05 και 0,09 U/mg για την κατεχόλη και την υδροκινόνη αντίστοιχα. Οι σταθερές ΚΜ και Vmax είναι ίσες με 61 και 165 μΜ και 2,4 και 4,6 U/mg για τις PcLac1 και PcLac2 ως προς το ABTS, ενώ τα αντίστοιχα μεγέθη για την 2,6-DMP είναι 672 και 1070 μΜ και 0,36 και 0,04 U/mg. Λειτουργική σταθερότητα παρατηρείται σε pH 5-9 για την PcLac1 και σε pH 5-8 για την PcLac2. Η λακκάση PcLac1 διατηρεί το 70% της ενεργότητάς της μετά από επώαση 2 h στους 50⁰C και 4 h στους 40⁰C, ενώ αντίστοιχα η PcLac2 δεν είναι σταθερή σε υψηλές θερμοκρασίες αλλά διατηρεί το 90% της ενεργότητάς της, μετά από 24 h στους 30⁰C. Παρουσία οργανικών διαλυτών (μεθανόλη, αιθανόλη, ακετόνη, DMSO, 1,4-διοξάνη), η PcLac1 παρεμποδίζεται ακόμα και σε 10% περιεκτικότητάς τους ενώ η PcLac2 είναι σταθερή σε διαλύματα 10% των διαλυτών. Οι λακκάσες παρεμποδίζονται έντονα παρουσία SDS 1mM και NaN3, ενώ η PcLac1 ενεργοποιείται σε Cu 0,25 mM και Η2Ο2 1 mM. Οι αποδόσεις που λαμβάνονται από την αξιοποίηση των ενζύμων σε αντιδράσεις σύνθεσης είναι 36% (mg προϊόντος/mg υποστρώματος) ως προς το σιναπικό και 6,8% ως προς το φερουλικό για την PcLac1 αλλά και 81,5% ως προς το σιναπικό για την PcLac2, χωρίς ωστόσο να ταυτοποιηθούν οι ενώσεις στα στερεά προϊόντα. Τα ένζυμα του εξωκυτταρικού υγρού της καλλιέργειας (15,8 mg/mL πρωτεΐνης) ακινητοποιήθηκαν σε CLEAs, με χρήση θειικού αμμωνίου, ως παράγοντα κατακρήμνισης, και 100 mM γλουταραλδεΰδης για την σχηματισμό σταυροδεσμών, οπότε και επετεύχθη ανάκτηση της ενζυμικής ενεργότητας 60%. Τα CLEAs των λακκασών δρουν βέλτιστα σε pH 3, σε αντίθεση με το ελεύθερο ενζυμικό παρασκεύασμα όπου δρα σε pH 4, και 40 ⁰C. Η ακινητοποίηση βελτιώνει τη σταθερότητα του ενζυμικού παρασκευάσματος κατά την επώαση στους 50 και 60⁰C αλλά και στην περίπτωση επώασης σε οργανικούς διαλύτες αιθανόλη, μεθανόλη, ακετόνη, DMSO και 1,4-διοξάνη. Δοκιμάστηκε τέλος η χρήση ελεύθερου και ακινητοποιημένου ενζυμικού παρασκευάσματος για την αποτοξικοποίηση υγρών αποβλήτων ελαιουργείου, με το ελεύθερο ενζυμικό παρασκεύασμα να πετυχαίνει έως και 35% αποχρωματισμό του ΥΑΕ και έως 65% μείωση φαινολικών ενώσεων, ενώ τα CLEAs εμφάνισαν αντίστοιχα 20-30% αποχρωματισμό και 10% μείωση φαινολικού φορτίου.	el
heal.abstract	Laccases, as oxidoreductive enzymes, are part of the lignolytic enzyme system of Basidiomycetes, with great prospect of use in biotechnological applications, such as in the field of lignocellulosic biomass treatment and utilization. In the context of this thesis, the enzymatic lignolytic system of the white rot Basidiomycete Pleurotus citrinopileatus was studied. Purified fungal laccases, PcLac1 and PcLac2, were biochemically characterized while the enzymes of the culture supernatant were immobilized and the resulting enzymatic preparations were used in different biotechnological applications. Laccases PcLac1 and PcLac2, with molecular weights 40 and 80 kDa as well as formal potentials of 250 and 200 mV respectively, show characteristic absorbance at about 330 nm, while PcLac1 also absorbs at 610 nm. The isoelectric point of PcLac1 is at pI 3,5. PcLac1 showed optimum activity at pH 4,5 and 55⁰C whereas optimum conditions for PcLac2 were pH 4 and 55⁰C, based on ABTS enzymatic activity measurements. The two laccases oxidize hydrobenzoles and hydroxycinnamic acids, as PcLac1 shows optimized activity with 2,6-DMP and hydroquinone (0,08 U/mg), while PcLac2 has activity of 0,05 and 0,09 U/mg for catechol and hydroquinone respectively. Michaelis-Menten constants ΚΜ and Vmax equal to 61 and 165 μΜ as well as 2,4 and 4,6 U/mg for PcLac1 and PcLac2 using ABTS as substrate, while the corresponding measurements for 2,6-DMP are 672 and 1070 μΜ as well as 0,36 and 0,04 U/mg. Furthermore PcLac1 shows better stability at pH 5 to 9, whereas PcLac2 is more stable at pH 5 to 8. Regarding temperature stability, PcLac1 preserves 70% of its activity after 2 h incubation at 50⁰C and 4 h at 40⁰C. However, PcLac2 preserves 90% of its activity after 24 h incubation at 30⁰C, even though it is not stable in high temperatures. In the presence of organic solvents (methanol, ethanol, acetone, DMSO, 1,4-dioxane), PcLac1 is inhibited even at concentrations of 10% (v/v), while PcLac2 is stable at the same concentrations. Laccases are also strongly inhibited by 1mM SDS and NaN3, while the activity of PcLac1 is enhanced by 0,25 mM Cu and 1 mM Η2Ο2. The enzymes were finally used in organic synthesis reactions. The mass yields (mg of product/mg of substrate) were 36% in regard to sinapic acid and 6,8% in regard to ferulic acid for PcLac1, whereas PcLac2 yielded 81,5% in regard to sinapic acid. However, the nature of the solid products was not identified. The enzymes of the fungal supernatant (15,8 mg/mL protein) were immobilized with the formation of CLEAs, using ammonium sulfate as precipitant, and 100 mM of glutaraldehyde, as the cross-linking agent, achieving 60% activity recovery. Laccase CLEAs show optimal activity at pH 3, in contrast to the non-immobilized enzymatic preparation, which shows higher activity at pH 4, and 40 ⁰C. The immobilization of the enzymes improves their stability during incubation at 50 and 60⁰C, as well as in the presence of organic solvents (methanol, ethanol, acetone, DMSO, 1,4-dioxane). Finally, the immobilized enzyme preparation was tested to the detoxification of oil mill wastewater (OMW), by which the non-immobilized enzymes achieved up to 35% decolorization of OMW as well as 65% reduction of the total phenolic compounds, while CLEAs showed respectively 20 to 30% decolorization and 10% reduction on the phenolic content.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Σαρίμβεης, Χαράλαμπος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	162 σ.	el
heal.fullTextAvailability	true