Ανακάλυψη καινοτόμων ενζύμων με ενεργότητα λακκάσης από θαλάσσιους μυκητιακούς συμβιώτες μεσόφωτων ασπόνδυλων

Σιαπέρας, Ρωμανός; Siaperas, Romanos

dc.contributor.author	Σιαπέρας, Ρωμανός	el
dc.contributor.author	Siaperas, Romanos	en
dc.date.accessioned	2019-05-16T08:47:55Z
dc.date.available	2019-05-16T08:47:55Z
dc.date.issued	2019-05-16
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/48741
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.16322
dc.rights	Default License
dc.subject	Βιοτεχνολογία	el
dc.subject	Μύκητες	el
dc.subject	Περιβάλλον	el
dc.subject	Λακκάση	el
dc.subject	Απομόνωση	el
dc.subject	Biotechnology	el
dc.subject	Fungi	el
dc.subject	Enviroment	el
dc.subject	Laccase	el
dc.subject	Isolation	el
dc.title	Ανακάλυψη καινοτόμων ενζύμων με ενεργότητα λακκάσης από θαλάσσιους μυκητιακούς συμβιώτες μεσόφωτων ασπόνδυλων	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2019-02-20
heal.abstract	Τα θαλάσσια οικοσυστήματα φιλοξενούν μια πλούσια ποικιλία μικροοργανισμών που αποτελούν τεράστια πηγή πιθανών βιοκαταλυτών με καινοτόμες ιδιότητες, λόγω της προσαρμογής τους στις ξεχωριστές συνθήκες του θαλάσσιου περιβάλλοντος. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διαλογή θαλάσσιων μυκήτων, οι οποίοι αποικοδομούν το πολυχλωριωμένο διφαινύλιο PCB 29, ως προς τη δυνατότητά τους να εκφράζουν ενεργότητες λακκάσης, καθώς και η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός τέτοιων ενζύμων. Αρχικά πραγματοποιήθηκε διαλογή μεταξύ 9 μικροοργανισμών για την ανάδειξη του αποτελεσματικότερου παραγωγού λακκάσης σε καλλιέργειες που είχε προστεθεί το PCB 29. Από τους 9 μικροοργανισμούς μόνο ένα στέλεχος, το οποίο ταυτοποιήθηκε ως στέλεχος Cladosporium sp. παρήγαγε αξιοσημείωτη ποσότητα λακκάσης εμφανίζοντας ενεργότητα που έφτασε τα 188,4 U/g πρωτεΐνης. Έπειτα μελετήθηκε η επαγωγή της έκφρασης λακκάσης σε υγρές καλλιέργειες. Πρώτα μελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών ουσιών ως επαγωγείς της ενεργότητας λακκάσης και την καλύτερη επίδραση την παρουσίασε η προσθήκη χαλκού στο μέσο καλλιέργειας αυξάνοντας την ενεργότητα λακκάσης 2,5 φορές σε σχέση με την απουσία επαγωγέα. Λόγω αυτού έγινε μελέτη της επίδρασης διαφορετικών συγκεντρώσεων χαλκού στην ενεργότητα λακκάσης και η βέλτιστη συγκέντρωση βρέθηκε να είναι 0,25-0,5 mM. Ακολούθησαν καλλιέργειες του μικροοργανισμού και παραγωγή λακκάσης σε μεγάλες ποσότητες και προσπάθεια απομόνωσης αυτής με χρήση στηλών χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής. Κατά τη διαδικασία αυτή απομονώθηκαν δύο διαφορετικές λακκάσες από το μικροοργανισμό, οι Lac1 και Lac2. Η απομόνωση τους πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια και η ηλεκτροφόρηση των δύο πρωτεϊνών σε SDS-PAGE έδειξε ότι τα μοριακά βάρη των λακκασών Lac1 και Lac2 ήταν 65 και 75 kDA αντίστοιχα. Η βέλτιστη ενεργότητα παρουσιάστηκε και στα δύο απομονωμένα ένζυμα για pH 3 και 50 οC με βάση μετρήσεις ενεργότητας στο υπόστρωμα ABTS. Ακολούθησε η μελέτη της εκλεκτικότητας υποστρώματος όπου οι δύο λακκάσες παρουσίασαν μικρές διαφορές με τη Lac1 όμως να οξειδώνει μεγαλύτερο εύρος υποστρωμάτων. Οι δύο λακκάσες έδειξαν αδυναμία να οξειδώσουν το υπόστρωμα L-DOPA. Τέλος πραγματοποιήθηκε μελέτη της δυνατότητας αποικοδόμησης του΄ρύπου PCB 29 συγκέντρωσης 1 μM από τις δύο λακκάσες απουσία μεσολαβητή και παρουσία μεσολαβητή ABTS. Η μεγαλύτερη ποσοστιαία απομάκρυνση του PCB ήταν 70,8% και επιτεύχθηκε στις αντιδράσεις της Lac2 παρουσία ABTS. Απουσία μεσολαβητή τα δύο απομονωμένα ένζυμα μείωσαν τη συγκέντρωση του PCB περίπου 29%.	el
heal.abstract	Marine ecosystems host a wide variety of microorganisms and contain an enormous pool of potential biocatalysts with novel properties as a result of their adaptation capability in the unique marine environment conditions. The purpose of this diploma thesis was the screening of marine-derived fungi capable of biodegrading the polychlorinated biphenyl PCB 29 for laccase activity and the isolation and characterization of these enzymes. Initially screening of nine strains for laccase production was performed in presence of PCB 29. Only one strain, which was identified as Cladosporium sp. showed notable laccase activity, reaching 188,4 U/g protein. Furhermore, several laccase production inducers were tested in liquid cultures of these fungi. Among the different compounds that were tested, copper had the most significant impact causing a 2,5 fold increase in laccase activity compared to the absence of an inducer. The effect of different copper concentrations on laccase activity was also studied showing optimal activity in the concentration range from 0,25 to 0,5 mM. Microorganism culture and laccase production were scaled up and interconnected to an ion exchange chromatography column to isolate the laccase produced. During this process two different laccases were isolated, Lac 1 and Lac2. Isolated Lac1 and Lac2 whilst a two-stage purification process and SDS-PAGE analysis revealed the molecular weights of the laccases Lac1 and Lac2 to be 65 and 75 kDA respectively. ο Both laccases showed optimum activity at pH 3 and 50 C, based on ABTS enzymatic activity measurements. The substrate specificity of the laccases was studied and both laccases showed similar behavior, however Lac1 oxidized a broader range of substrates than Lac2. Both laccases failed to oxidize the substrate L-DOPA. Finally, both purified laccases were studied for the degradation of PCB 29 at initial concentration of 1μM in presence and absence of ABTS mediator. The maximum removal percentage of PCB was 70,8% and was measured in the reactions of Lac2 in presence of ABTS. In absence of a mediator both enzymes reduced the PCB concentration by 29%.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Μαρούλης, Ζαχαρίας	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	118 σ.
heal.fullTextAvailability	true