Επίδραση φυσικών προϊόντων σε ανθρώπινα κύτταρα ηπατοκαρκινώματος - Μηχανιστική ανάλυση

Παπαζήση, Μαριάννα; Papazisi, Marianna

dc.contributor.author	Παπαζήση, Μαριάννα	el
dc.contributor.author	Papazisi, Marianna	en
dc.date.accessioned	2019-05-20T08:33:42Z
dc.date.available	2019-05-20T08:33:42Z
dc.date.issued	2019-05-20
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/48779
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.16288
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Φυσικά προϊόντα	el
dc.subject	Ηπατοκαρκίνωμα	el
dc.subject	EGCG	en
dc.subject	Hep3B	en
dc.subject	Σηματοδοτικά μονοπάτια	el
dc.subject	Φαρμακοτρόφιμα	el
dc.subject	Πολυφαινολικές ενώσεις	el
dc.subject	Real Time RT-qPCR	en
dc.subject	MTT	en
dc.subject	HCC	en
dc.title	Επίδραση φυσικών προϊόντων σε ανθρώπινα κύτταρα ηπατοκαρκινώματος - Μηχανιστική ανάλυση	el
heal.type	bachelorThesis
heal.generalDescription	Συνεργασία με τη Μονάδα Κλινικής και Εργαστηριακής Έρευνας, Εργαστήριο Μελετών Εντατικής και Επείγουσας Ιατρικής «Γ. Π. Λιβανός» και το Εργαστήριο Εφαρμοσμένης Βιοϊατρικής Έρευνας και Εκπαίδευσης «Μ. Σίμου», Α’ Κλινική Εντατικής Θεραπείας, Νοσοκομείο Ευαγγελισμός, Τομέας Παθολογίας, Ιατρική Σχολή Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών	el
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classificationURI	http://data.seab.gr/concepts/17d26c7ad4b1baa3e1976533f499eef793ef5338
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2019-02-19
heal.abstract	Το Ηπατοκυτταρικό Καρκίνωμα (Hepatocellular Carcinoma, HCC) αποτελεί έναν τύπο καρκίνου με αυξημένη αγγειογενετική δράση, που στην πλειοψηφία των περιπτώσεων συνοδεύεται από προχωρημένη ίνωση ή κίρρωση και χρόνια φλεγμονή του ήπατος, ως αποτέλεσμα διαφόρων αρχικών αιτιολογικών παραγόντων (ιογενείς ηπατίτιδες B και C, χρόνια κατανάλωση αλκοόλ, διατροφική έκθεση στην αφλατοξίνη Β1, μη αλκοολική λιπώδης νόσος του ήπατος). Δεδομένων των σύνθετων μοριακών μηχανισμών που απαρτίζουν το ετερογενές μοριακό προφίλ της νόσου, οι σύγχρονες έρευνες για την πρόληψη και τη θεραπεία της εξετάζουν προσεγγίσεις που στοχοποιούν πολλαπλούς μοριακούς παράγοντες. Στο πλαίσιο αυτό, ιδιαίτερη έμφαση έχει δοθεί στην αξιοποίηση φυτικών προϊόντων, αφού εμφανίζουν πολλαπλή βιοδραστικότητα, ενώ δρουν συνεργιστικά με άλλα φυσικά ή/και συνθετικά προϊόντα, καθώς και με καθιερωμένα αντι-καρκινικά φάρμακα και θεραπείες. Μια χαρακτηριστική ομάδα ενώσεων φυτικής προέλευσης, με ευρέως γνωστή αντιοξειδωτική δράση, που εμφανίζει μεγάλο φαρμακολογικό ενδιαφέρον είναι αυτή των πολυφαινολικών ενώσεων. Στην ομάδα αυτή συμπεριλαμβάνεται ο γαλλικός επιγαλλοκατεχυλεστέρας (Epigallocatechin Gallate, EGCG), που αποτελεί την κυριότερη κατεχίνη του πράσινου τσαγιού και έχει αποδεδειγμένη αντικαρκινική και προστατευτική δράση σε ανθρώπινα HCC. Η παρούσα διπλωματική εργασία εντάσσεται στην προσπάθεια της επιστημονικής ομάδας του εργαστηρίου της Δρ. Ελένης Λουτράρη να διερευνηθούν οι μηχανισμοί δράσης συγκεκριμένων φυσικών ενώσεων που χαρακτηρίζονται ως φαμακοτρόφιμα, συμπεριλαμβανομένης της EGCG, έναντι HCC κυτταρικών σειρών σε επίπεδο μεταβολών έκφρασης ολόκληρου του γονιδιώματος. Πιο συγκεκριμένα, αντικείμενο της διπλωματικής εργασίας αποτελεί η πειραματική επιβεβαίωση μέρους αποτελεσμάτων αλληλούχισης RNA (RNA sequencing, RNA-seq) του εργαστηρίου με τη μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής σε συνδυασμό με την ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (Real Time Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction, Real-Time RT-qPCR). Για τον σκοπό αυτό καλλιεργήθηκαν κύτταρα της καρκινικής σειράς Hep3B, τα οποία εκτέθηκαν σε προεπιλεγμένη συγκέντρωση EGCG (25 μΜ), παρουσία ή απουσία μίγματος ερεθισμάτων (TGF-a, IL-6, IL-1b) που είναι γνωστό ότι συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση των HCC με το μικροπεριβάλλον τους, προωθώντας την ενεργοποίηση σημαντικών προ-καρκινικών σηματοδοτικών μονοπατιών. Κατόπιν απομόνωσης και ελέγχου της καθαρότητας του ολικού RNA των καρκινικών κυττάρων, πραγματοποιήθηκε in vitro αντίστροφη μεταγραφή του RNA σε cDNA και ανάλυση με Real-Time qPCR της έκφρασης των γονιδίων ADAMTS9, CLIC3, HSPA2, SERPINE1, HSPB1, PDGFRB και ΜΜΡ9. Τα γονίδια αυτά επιλέχτηκαν με βάση την προηγηθείσα βιοπληροφορική ανάλυση των RNA-seq δεδομένων, καθώς η μεταβολή στην έκφρασή τους βρέθηκε να συνδέεται στατιστικά σημαντικά με βιολογικές διαδικασίες/μονοπάτια σχετιζόμενα με την αγγειογένεση, τη ρύθμιση της κυτταρικής αύξησης, την αλληλεπίδραση με την εξωκυττάρια μήτρα και την κυτταρική μετανάστευση. Σημειώνεται ότι η μέθοδος Real-Time RT-qPCR εφαρμόστηκε τόσο σε ανεξάρτητο πείραμα, όσο και στο υλικό RNA που χρησιμοποιήθηκε για το RNA-seq. Από την επεξεργασία των πειραματικών αποτελεσμάτων Real-Time RT-qPCR προέκυψε ότι τα γονίδια ADAMTS9, MMP9 και SERPINE1 υπερεκφράζονται, ενώ τα PDGFRB, HSPB1, HSPA2 και CLIC3 υποεκφράζονται μετά από έκθεση σε EGCG σε σχέση με το μάρτυρα. Τα αποτελέσματα αυτά επαληθεύουν τα δεδομένα του RNA-seq και, συνεπώς, υποστηρίζουν την εγκυρότητα της βιοπληροφορικής ανάλυσης που υποδεικνύει ότι οι δράσεις του EGCG διαμεσολαβούνται από μεταβολές στη έκφραση γονιδίων που συνδέονται στατιστικά σημαντικά με αξιόλογες για την πρόοδο του καρκίνου βιολογικές διαδικασίες (αγγειογένεση, κυτταρική αύξηση, εξωκυττάρια μήτρα, κυτταρική μετανάστευση). Επιπρόσθετα, τα αποτελέσματα, σε συνδυασμό με την υπάρχουσα βιβλιογραφία, υποδηλώνουν ότι η διαφορική γονιδιακή έκφραση πιθανά συνδέεται με την επίδραση του ΕGCG σε κομβικούς μεταγραφικούς παράγοντες ή/και στην παρεμπόδιση της μεθυλίωσης των εξεταζόμενων γονιδίων στα ανθρώπινα HCC.	el
heal.abstract	Hepatocellular Carcinoma (HCC) is a type of cancer characterized by increased angiogenesis, that develops in a background of cirrhosis and chronic inflammation. HCC incidence is associated with multiple causative factors, the most important of which being chronic infection with hepatitis B virus (HBV) or hepatitis C virus (HCV), excessive consumption of alcohol, dietary exposure to aflatoxin B1 and non alcoholic fatty liver disease. Due to the complex molecular mechanisms and multifactorial etiology of HCC, research for cancer prevention and treatment nowadays focuses on multi - target pharmacologic app roaches. In this spirit, the scientific community shows an intense interest in the potential use of plant - derived products, due to their mutliple bioactivity and synergistic effects with other natural or synthetic products, established anticancer drugs an d therapies. A group of plant - derived compounds, widely known for their antioxidant activity, that is promising for pharmaceutical development , is plant phenolics. A member of this class is Epigallocatechin Gallate (EGCG), the main green tea catechin , with known anticancer and protective properties in human HCC. The present diploma thesis is a small part of Dr. H. Loutrari’s research team’s work, concerning the mechanisms of action of specific natural products described as nutraceuticals (including EGCG) on whole - genome gene expression changes in HCC cell lines. More elaborately, the aim of this thesis is the experimental validation of part of the existing RNA - seq data through the Real Time Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction (Real - T ime RT - qPCR) method. For this purpose, Hep3B cancer cell cultures were seeded and subsequently exposed to a selected EGGC dose (25 μΜ ), in the presence or absence of a proinflammatory stimuli mixture (TGF - a, IL - 6, IL - 1b) known for its role in HCC interacti ons with the tumor microenvironment and activation of significant precancerous signaling pathways. The total isolated RNA from the cancer cells was subjected to quality assessment and then used for in vitro reverse transcription (cDNA synthesis) and Real - T ime qPCR analysis. This analysis focused on the expression of the genes ADAMTS9, CLIC3, HSPA2, SERPINE1, HSPB1, PDGFRB and ΜΜΡ9. Those genes occurred from previous bioinformatic analysis of the RNA - seq data, because their statistically significant differen tial expression is associated with biological processes/pathways related to angiogenesis, cell growth control, cell - extracellular matrix (ECM) interactions and cell migration. It is noted that the Real - Time RT - qPCR method was applied both in an independent experiment and in the isolated RNA that was used for the RNA sequencing. Statistical analysis of the experimental data showed overexpression of genes ADAMTS9, MMP9 and SERPINE1 and underexpression of genes PDGFRB, HSPB1, HSPA2 and CLIC3 after exposure to EGCG compared to the control sample. These results confirm the previous RNA - seq data and, therefore, validate the bioinformatics analysis which indicates that EGCG effects mediate statistically significant changes in the expression of genes connected to bi ological processes of great importance to cancer development (angiogenesis, cell growth, ECM, cell migration). Moreover, the a fore mentioned results , in conjunction with the existing literature , suggest that the differential expression of the examined genes in HCC is possibly associated with EGCG’s influence on crusial transcription factor s and/or DNA - methylation inhibition	en
heal.advisorName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τσακανίκας, Άγγελος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	81 σ.
heal.fullTextAvailability	true