Ανίχνευση σύνθετων βλαβών DNA μέσω της μεθόδου συνεντοπισμού επιδιορθωτικών πρωτεϊνών Pclc

Μακρή, Αντιγόνη Ζαχαρούλα; Makri, Antigoni Zacharoula

dc.contributor.author	Μακρή, Αντιγόνη Ζαχαρούλα	el
dc.contributor.author	Makri, Antigoni Zacharoula	en
dc.date.accessioned	2019-06-24T10:55:57Z
dc.date.available	2019-06-24T10:55:57Z
dc.date.issued	2019-06-24
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/48896
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.15649
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Βλάβες DNA	el
dc.subject	Επιδιόρθωση DNA	el
dc.subject	Μέθοδος Pclc	el
dc.subject	Ιοντίζουσα ακτινοβολία	el
dc.subject	Pclc method	en
dc.subject	γH2AX foci	en
dc.subject	Ionizing radiation	en
dc.subject	DNA repair	en
dc.subject	DNA damage	en
dc.subject	Εστίες γH2AX	el
dc.title	Ανίχνευση σύνθετων βλαβών DNA μέσω της μεθόδου συνεντοπισμού επιδιορθωτικών πρωτεϊνών Pclc	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοφυσική	el
heal.classification	Ιατρική φυσική	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2019-03-28
heal.abstract	Οι δίκλωνες θραύσεις (ΔΚΘ) αποτελούν τις πιο επικίνδυνες βλάβες που υφίσταται βιολογικά το DNA, καθώς μπορεί να οδηγήσουν σε απώλεια μεγάλου τμήματος του γονιδίου και άρα σε μεταλλάξεις, όπως είναι η καρκινογένεση. Έπειτα από έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία, οι πρωτεΐνες ελέγχου και επιδιόρθωσης επεμβαίνουν μέσα σε δευτερόλεπτα και συσσωρεύονται γύρω από τη ΔΚΘ, δημιουργώντας εστίες επιδιόρθωσης. Μια πολύ σημαντική πρωτεΐνη επιδιόρθωσης είναι η ιστόνη Η2ΑX η οποία κοντά σε ΔΚΘ μετατρέπεται άμεσα στη φωσφορυλιωμένη της μορφή, τη λεγόμενη γΗ2ΑX. Οι εστίες επιδιόρθωσης πειραματικά μπορούν να χρωστούν με τη βοήθεια αντισωμάτων τα οποία αφενός προσδένονται επιλεκτικά σε συγκεκριμένες και επιλεγμένες από εμάς πρωτεΐνες επιδιόρθωσης και αφετέρου φθορίζουν. Με τη μέθοδο αυτή, τη μέθοδο in situ ανοσοφθορισμού, γίνεται δυνατή η παρατήρηση στο μικροσκόπιο των εστιών επιδιόρθωσης, ως εστίες φθορισμού. Η μέθοδος λοιπόν οπτικοποιεί τις ΔΚΘ στη θέση που συμβαίνουν μέσα στο κύτταρο (in situ), μέσω της πρόσδεσης των αντισωμάτων που φθορίζουν στις πρωτεΐνες επιδιόρθωσης των ΔΚΘ. Η 53ΒΡ1 είναι μία ακόμα πρωτεΐνη που μετατοπίζεται γρήγορα στις θέσεις των θραύσεων του DNA μετά την έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία και συσσωματώνεται ταχέως με τη γΗ2ΑX. Η μέθοδος ανοσοφθορισμού των εστιών της γΗ2ΑX είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική αφού έχει επαληθευθεί μία γραμμική συσχέτιση ανάμεσα στον αριθμών των εστιών γΗ2ΑX και της δόσης ακτινοβολίας, όταν πρόκειται για ακτινοβολίες χαμηλής LET. Η έκφραση γΗ2ΑX χρησιμοποιείται ευρέως ως ο πρώτος γνωστός δείκτης διάσπασης χρωμοσωματικού DNA και συγκεκριμένα ως ένας ευαίσθητος δείκτης ΔΚΘ επαγόμενων από ιοντίζουσα ακτινοβολία. Οι αναλύσεις της παρούσας διπλωματικής εργασίας, βασίζονται σε πείραμα με ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα από καρκίνωμα του πνεύμονα τύπου Α549, εκτεθειμένα σε ακτίνες –X, παρουσία ή μη του αναστολέα της DNA-PK, NU7441. Αρχικά, εξετάζεται η συμπεριφορά των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης των ΔΚΘ, γH2AX και 53BP1, στα καρκινικά κύτταρα Α549 και μετρώνται για διάφορες δόσεις και για διαφορετικές χρονικές στιγμές η δημιουργία εστιών φθορισμού, παρουσία και μη του αναστολέα της DNA-PK, NU7441. Στη συνέχεια, γίνεται σύγκριση των λογισμικών IMARIS και JQuantPlus, για τη μέτρηση των εστιών γH2AX και 53ΒP1 με σκοπό τη διερεύνηση της δυνατότητας καταμέτρησης των εστιών φθορισμού από εικόνες συνεστιακής μικροσκοπίας (3D), με το λογισμικό JQuantPlus, το οποίο αναλύει εικόνες 2D. Στη συνέχεια, λόγω της μεγάλης σημασίας των εστιών στην ανίχνευση των ΔΚΘ, μελετάται η ανίχνευση συνεντοπισμού μεταξύ των πρωτεϊνών γH2AX και 53BP1 μέσω της παραμέτρου Pclc, η οποία συγκρίνει την επιφανειακή φωτεινότητα του σήματος από την επισημασμένη πρωτεΐνη επιδιόρθωσης των βλαβών βάσεων, η οποία είναι ορισμένη στις εστίες φθορισμού των ΔΚΘ, με το ίδιο μέγεθος ορισμένο στον υπόλοιπο πυρήνα του κυττάρου. Τέλος, διερευνήθηκε η επιδιόρθωση των ΔΚΘ σε συνάρτηση με τον ενδοκυττάριο εντοπισμό της βλάβης, και συγκεκριμένα ως προς την ευχρωματίνη και ετεροχρωματίνη. Αρχικά, μέσω του λογισμικού ΙMARIS,έγινε ο υπολογισμός της παραμέτρου συνεντοπισμού Pclc του DAPI πάνω στις γH2AX και στη συνέχεια στις 53BP1 εστίες. Προκειμένου να μειωθεί το σφάλμα για τον υπολογισμό του Pclc, λόγω των εμβαδών της επιφάνειας που χρησιμοποιείται στο Pclc εξ’ ορισμού, με χρήση των λογισμικών επεξεργασίας εικόνων JCountPro και JQuantPlus, ακολουθήθηκε μια λεπτομερής διαδικασία αποφυγής και εξαίρεσης των πυρηνίσκων στις εικόνες 2D. Αυτό έγινε, καθώς το DNA στους πυρηνίσκους είναι μονόκλωνο και το DAPI δε μπορεί να βάψει την περιοχή αυτήν και επομένως δεν έχουμε εμφάνιση ΔΚΘ, άρα ούτε και εστιών.	el
heal.abstract	Double Strand Breaks (DSBs) are the most dangerous DNA lesions, because they can lead to great loss of genome and thus to mutations, such as carcinogenesis. After exposure to ionizing radiation, repair proteins interfere within seconds and accumulate around the DSBs, creating repair sites. The histone H2AX, which is one of the most significant repair proteins, is phosphorylated rapidly around the DSBs; its phosphorylated form is called ‚ 'γH2AX'. The repair sites can be experimentally stained by antibodies that are bound selectively to specific repair proteins and to emit fluorescence. By following this method, known as ‘in situ indirect immunofluorescence’, the repair sites are now visualized in the form of ‘foci’. Thus, this method visualizes DSBs in situ, through the binding of the specific antibodies against human DNA repair proteins of DSBs. The induction of γH2AX foci and their progress reflect the induction of DSBs in cells (in situ) and the progress of their repair. The p53-binding protein 1, 53BP1, moves rapidly at the site of DNA damage and forms readily visualized ionizing radiation induced foci. The method of immunofluorescence shows that the induction of γH2AX foci is linearly correlated with radiation dose, in the case of low LET radiation. Overall, γH2AX foci serve as a sensitive marker of DNA DSB induction. In this thesis, the analysis is based on human lung cancer cells A549, which were exposed to X-rays. Moreover, chemical inhibition of the DNA repair protein DNA-PK was induced in cell culture, using the inhibitor NU7441. Secondly, there was a comparison between IMARIS and JQuantPlus software applications for counting γH2AX and 53BP1 foci, in order to evaluate the measurability of foci from images that come from confocal microscopy (3D) and JQuantPlus, which analyzes 2D images. Subsequently, in view of the great importance of foci for the detection of DSBs, we used the parameter Pclc in order to evaluate the colocalization between γH2AX and 53BP1. Pclc compares the surface luminosity of the signal coming from the labeled antibody that targets the base repair enzymes, considered over the DSB foci area, with the same value considered over the rest of the cell nucleus area. Finally, the repair of DSBs was examined in relation to intracellular localization of the lesion, particularly in euchromatin and heterochromatin. By using the IMARIS software, Pclc of DAPI over the γH2AX foci and Pclc of DAPI over the 53BP1 foci were calculated. In order to reduce the error of Pclc, a detailed procedure was followed to eliminate the nucleoli in 2D images by using JCountPro and JQuantPlus software products, because of the surface area used in the definition of parameter Pclc. That was considerd, as DNA in nucleoli is single-stranded and so DAPI cannot stain that area and therefore does not appear DSBs nor foci.	en
heal.advisorName	Γεωργακίλας, Αλέξανδρος	el
heal.committeeMemberName	Μακροπούλου, Μυρσίνη	el
heal.committeeMemberName	Κόκκορης, Μιχαήλ	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Εφαρμοσμένων Μαθηματικών και Φυσικών Επιστημών. Τομέας Φυσικής	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	176 σ.	el
heal.fullTextAvailability	true