Ανακάλυψη καινοτόμων ενζύμων με ενεργότητα νιτριλάσης από θαλάσσιους μυκητιακούς συμβιώτες μεσόφωτων ασπόνδυλων

Παναγιωτοπούλου, Μαργαρίτα; Panagiotopoulou, Margarita

dc.contributor.author	Παναγιωτοπούλου, Μαργαρίτα	el
dc.contributor.author	Panagiotopoulou, Margarita	en
dc.date.accessioned	2019-07-01T11:07:24Z
dc.date.available	2019-07-01T11:07:24Z
dc.date.issued	2019-07-01
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/48953
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.16731
dc.rights	Default License
dc.subject	Μύκητες	el
dc.subject	Fungi	en
dc.subject	Νιτριλάσες	el
dc.subject	Νιτρίλια	el
dc.subject	Ρύποι	el
dc.subject	Βιοεξυγίανση	el
dc.subject	Nitrilases	en
dc.subject	Nitriles	en
dc.subject	Pollutants	en
dc.subject	Bioremediation	en
dc.title	Ανακάλυψη καινοτόμων ενζύμων με ενεργότητα νιτριλάσης από θαλάσσιους μυκητιακούς συμβιώτες μεσόφωτων ασπόνδυλων	el
dc.title	Discovery of novel enzymes with nitrilase activity from marine fungal invertebrates	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Περιβαλλοντική βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Environmental biotechnology	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2018-10-04
heal.abstract	Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της ικανότητας μυκήτων προερχόμενων από θαλάσσια ασπόνδυλα της μεσόφωτης ζώνης για αποικοδόμηση του αδιπονιτριλίου, του ακετονιτριλίου και της 2- αμινο-3-χλώρο-5-κυανοπυριδίνης. Έγινε προσπάθεια κατανόησης του μηχανισμού με τον οποίο πραγματοποιείται η υδρόλυση των νιτριλίων παρακολουθώντας τόσο αυτήν καθεαυτή τη μείωσή τους όσο και την παραγόμενη απ’ τη διάσπαση αμμωνία αλλά και με τον προσδιορισμό των ενζυμικών ενεργοτήτων που εκφράζουν. Αρχικά πραγματοποιήθηκε η διαδικασία της διαλογής (screening) με σκοπό την ανάδειξη των αποτελεσματικότερων μυκητιακών στελεχών για την αποικοδόμηση του αδιπονιτριλίου (αρχικής συγκέντρωσης 45 mM). Συγκεκριμένα έγινε ανάπτυξη τους σε διάλυμα αλάτων με μοναδική πηγή αζώτου και άνθρακα το νιτρίλιο αυτό και ανίχνευση της συγκέντρωσης της παραγόμενης από την υδρόλυση του, αμμωνίας. Σε 14 από τα 70 στελέχη η παραγωγή αμμωνίας βρέθηκε μεγαλύτερη ή ίση του 1mM με μόνο το στέλεχος 230-6 να δίνει 8,6 mM, τιμή 2,5 φορές υψηλότερη από το επόμενο σε παραγωγή αμμωνίας στέλεχος, ύστερα από 4 ημέρες. Ακολούθησαν μελέτες για το στέλεχος αυτό, που ταυτοποιήθηκε ως Penicillium citreonigrum, σε δείγματα απευθείας από το μέσο ανάπτυξης όπως έγινε και στη διαλογή (διεργασία με ολόκληρα κύτταρα). Πραγματοποιήθηκε σε βάθος 18 ημερών μέτρηση της παραγόμενης αμμωνίας με την παράλληλη καταγραφή της μείωσης του αδιπονιτριλίου που χρησιμοποιήθηκε σαν υπόστρωμα μέσω συσκευής Αέριας Χρωματογραφίας. Παρατηρήθηκε σταδιακή μείωση του υποστρώματος ενώ αντίστοιχα η παραγωγή αμμωνίας έδειξε αύξηση με το χρόνο με πειραματική αναλογία κατανάλωσης/παραγωγή: 1/1.3. Η υψηλότερη συγκέντρωση αμμωνίας που ανιχνεύθηκε ήταν 25 mM ενώ το αδιπονιτρίλιο ελαττώθηκε συνολικά κατά 41 % από την αρχική του συγκέντρωση. Ακόμα, η μέτρηση της τελικής βιομάζας έδειξε ότι η παρουσία υποστρώματος αδιπονιτριλίου οδήγησε σε διπλασιασμό της. Αντίστοιχη διαδικασία ακολουθήθηκε και για την 2-αμινο-3-χλώρο-5-κυανοπυριδίνη που ώστόσο δεν κατάφερε να υδρολυθεί και να καταναλωθεί από τα κύτταρα. Επιπλέον διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν για την μελέτη της ενζυμικής ενεργότητας νιτριλάσης με αξιοποίηση του εσωκυτταρικού υγρού. Σε πρώτη φάση εξετάστηκε η επίδραση της παρουσίας Mg2+. Η μελέτη έδειξε ενζυμική ενεργότητα 18,5 U/g πρωτεΐνης με το μεταλλοκατιόν ενώ απουσία αυτού ήταν μηδενική. Τέλος δημιουργήθηκαν αντιδράσεις με το ένζυμο παρουσία του αδιπονιτριλίου και του ακετονιτριλίου ως υποστρώματα. Παρατηρήθηκε ότι στον ίδιο χρόνο αντίδρασης το ακετονιτρίλιο υδρολύεται περισσότερο από το αδιπονιτρίλιο με την ενζυμική ενεργότητα να προκύπτει κατά 55 % υψηλότερη με υπόστρωμα 2 mΜ ACN σε σχέση με το AdN ίδιας συγκέντρωσης.	el
heal.abstract	The purpose of this diploma thesis was to study the ability of marine-derived fungi from mesophotic zones to decompose adiponitrile, acetonitrile and 2-amino-3-chloro-5-cyanopyridine. An attempt has been made to understand the mechanism by which the hydrolysis of nitriles is taking place by monitoring both their own concentration decreaze and the ammonia produced but also with the determination of the enzymatic actions they express. First of all, the screening procedure was performed to evaluate the most effective fungal strains for the degradation of adiponitrile (initial concentration 45 mM). Specifically, they were developed in a mineral medium with the nitrile as the sole source of nitrogen and carbon and the concentration of ammonia produced by its hydrolysis was detected. In 14 of the 70 strains ammonia production was found to be greater than 1 mM with only strain 230-6 giving 8.6 mM, 2.5 times higher than the second most capable strain, after 4 days. Further studies on this strain, that was identified as Penicillium citreonigrum, followed, in samples directly from the mineral medium, as in the screening (whole cell processing). The measurement of the ammonia produced was carried out for longer times (for 429 hours) with the parallel recording of the concentration decrease of adiponitrile used as a substrate using Gas Chromatography. A gradual decrease in the substrate was observed, while ammonia production showed an increase over time with an experimental consumption/production ratio of 1/1.3. The highest ammonia concentration detected was 25 mM whereas adiponitrile declined by 41% from its initial concentration. Moreover, measurment of the final biomass showed that the presence of adiponitrile as a substrate led to doubling its initial weight. The same procedure was followed for 2-amino-3-chloro-5-cyanopyridine which, however, failed to be hydrolysed and consumed by the cells. Additional processes were performed to study the nitrilase activity by utilizing the intracellular fluid. The effect of the presence of Mg2 + was first examined. The study showed an enzymatic activity of 18.5 U/g of protein while with its absence no activity was detected after 24 hours of reaction.Finally, reactions were created with the enzyme in the presence of adiponitrile and acetonitrile as substrates. It was observed that at the same reaction time acetonitrile’s hydrolysis was greater than adiponitrile’s with the enzyme activity being 55% higher with a 2mM ACN substrate relative to the same AdN concentration.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Καραγιάννη, Χάιδω-Στεφανία	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	128 σ.
heal.fullTextAvailability	true