dc.contributor.author | Περικλής-Μάριος, Σωτήρης![]() |
el |
dc.contributor.author | Periklis-Marios, Sotiris![]() |
en |
dc.date.accessioned | 2019-07-09T08:13:38Z | |
dc.date.available | 2019-07-09T08:13:38Z | |
dc.date.issued | 2019-07-09 | |
dc.identifier.uri | https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/48994 | |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.16765 | |
dc.rights | Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα | * |
dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/ | * |
dc.subject | Ζυμομύκητες | el |
dc.subject | Μικροοργανισμοί | el |
dc.subject | Asparaginase | en |
dc.subject | Enzyme | el |
dc.subject | Yeasts | el |
dc.subject | Microorganisms | el |
dc.subject | Bioreactors | el |
dc.subject | Ασπαραγινάσες | el |
dc.subject | Βιοαντιδραστήρες | el |
dc.subject | Ένζυμα | el |
dc.title | Παραγωγή L-ασπαραγινάσης από μη τροποιημένους ζυμομύητες | el |
dc.title | L-asparaginase production by yeasts | en |
heal.type | bachelorThesis | |
heal.classification | Βιοτεχνολογία | el |
heal.classification | Biotechnology | el |
heal.language | el | |
heal.language | en | |
heal.access | campus | |
heal.recordProvider | ntua | el |
heal.publicationDate | 2019-02-20 | |
heal.abstract | Η L-ασπαραγινάση (E.C. 3.5.1.1) είναι ένα ένζυμο υψηλής θεραπευτικής αξίας που χρησιμοποιείται κυρίως για τη θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου και επίσης έχει πρόσφατα εφαρμοστεί στη βιομηχανία τροφίμων για να μειώσει τα επίπεδα ακρυλαμιδίου, μίας πιθανώς καρκινογόνου ουσίας. Το ένζυμο υδρολύει το αμινοξύ L-ασπαραγίνη σε L-ασπαρτικό οξύ και αμμωνία. Η L-ασπαραγινάση (ASNase) είναι ένα βασικό ενζυμικό φάρμακο της συνδυαστικής θεραπείας έναντι ασθενειών όπως οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ALL), λεμφοσάρκωμα, λέμφωμα Hodgkins, λέμφωμα μη Hodgkins, οξεία μυελογενής λευχαιμία, οξεία μυελομονοκυτταρική λευχαιμία, χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία και μελανοσαρκώματα. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν μια ασυνήθιστη υψηλή απαίτηση για το μη απαραίτητο αμινοξύ L- ασπαραγίνη. Η ASNase εξαντλεί την L-ασπαραγίνη στο αίμα, εμποδίζοντας τη σύνθεση πρωτεϊνών και την σύνθεση DNA και RNA σε καρκινικά κύτταρα. Ως αποτέλεσμα, τα κύτταρα οδηγούνται σε απόπτωση. Στα υγιή κύτταρα, το ένζυμο συνθετάση ασπαραγίνης μετατρέπει το ασπαρτικό σε ασπαραγίνη χρησιμοποιώντας ΑΤΡ ως πηγή ενέργειας. Στον μηχανισμό αυτό, ο οξαλοξικός εστέρας μετατρέπεται σε ασπαρτικό με τη βοήθεια τρανσαμινάσης και μετά το ασπαρτικό μετατρέπεται σε ασπαραγίνη με τη βοήθεια συνθετάσης ασπαραγίνης. Επομένως, η χορήγηση ASNase δεν επηρεάζει τα υγιή κύτταρα. Τα καρκινικά κύτταρα δεν μπορούν να συνθέσουν L-ασπαραγίνη λόγω χαμηλών ποσοτήτων συνθετάσης ασπαραγίνης και κατά συνέπεια εξαρτώνται από την ασπαραγίνη που υπάρχει στο αίμα για την ανάπτυξή τους. Η ASNase μπορεί να βρεθεί σε ζωικές, σε φυτικές και μικροβιακές πηγές. Τα τελευταία χρόνια, η ASNase που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του καρκίνου παράγεται από βακτήρια. Υπάρχουν τρεις τύποι ASNase: ASNase από Escherichia coli (EcA), ASNase από Erwinia chrysanthemi (ErA) και μια PEGylated μορφή από E. coli ASNase (PEG EcA). Η EcA είναι θεραπεία πρώτης γραμμής στην Ευρώπη, με χρόνο ημιζωής 26h-30h. Η PEGylated EcA είναι θεραπεία πρώτης γραμμής στις ΗΠΑ, με χρόνο ημιζωής 5,5 ημερών έως 7 ημέρες. Τέλος, η ErA χρησιμοποιείται για τη μείωση των παρενεργειών αλλά έχει χρόνο ημιζωής μόνο 16h. Συνήθως, οι ασθενείς που παρουσιάζουν παρενέργειες σε έναν τύπο ASNase αλλάζουν σε άλλο προκειμένου να λάβουν την πιο αποτελεσματική θεραπεία. Η EcA περιέχει 100-300 U/mg πρωτεΐνης. Η PEGylated EcA περιέχει περίπου 70 U/mg πρωτεΐνης. Η ASNase από βακτηριακές πηγές προκαλεί πολλές παρενέργειες στον ασθενή, όπως αλλεργικές αντιδράσεις, αναφυλακτικά σοκ, οξεία παγκρεατίτιδα, υπεργλυκαιμία, ηπατοτοξικότητα και αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η χορήγηση ASNase είναι ικανή να προκαλέσει μία απόκριση του ανοσοποιητικού που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή αντισωμάτων, antiASNase, από τον ασθενή και τελικά οδηγεί στην κάθαρση του φαρμάκου από το αίμα, μειώνοντας την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου. Αυτή η αντίσταση στην ASNase μπορεί να είναι είτε συμπτωματική, προκαλώντας κλινική υπερευαισθησία είτε ασυμπτωματική. Η τελευταία ονομάζεται επίσης "σιωπηλή απενεργοποίηση" και θεωρείται πιο επικίνδυνη, καθώς δεν υπάρχουν συμπτώματα και μπορεί να εμφανιστεί σε περίπου 30% των ασθενών. Η εμπορική ASNase προέρχεται από βακτήρια και οι βακτηριακές πρωτεΐνες θεωρούνται ότι δημιουργούν σοβαρές παρενέργειες σε σύγκριση με τις ευκαρυωτικές πρωτεΐνες. Η ευκαρυωτική ASNase μπορεί να έχει αυξημένη αντικαρκινική δραστηριότητα και λιγότερες παρενέργειες στον ασθενή, αφού τα ευκαρυωτικά ένζυμα είναι πιο παρόμοια εξελικτικά με την ανθρώπινη πρωτεΐνη. Ορισμένες από τις σημαντικότερες παρενέργειες της ASNase, όπως η οξεία παγκρεατίτιδα, έχουν αποδοθεί στη δραστικότητα γλουταμινάσης που έχει η ASNase. Η L-ασπαραγίνη και η L- γλουταμίνη διαφέρουν δομικά με μία μόνο ομάδα μεθυλίου και έτσι η ASNase έχει διπλή εξειδίκευση υποστρώματος. Ως αποτέλεσμα, οι ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία με βακτηριακή ASNase δείχνουν χαμηλά επίπεδα L-γλουταμίνης στο αίμα που αναστέλλει άμεσα τη σύνθεση πρωτεϊνών. Η L-γλουταμίνη αντιπροσωπεύει το 50% όλων των ελεύθερων αμινοξέων, καθιστώντας την πολύ σημαντική πηγή αζώτου. Συνήθως, οι ασθενείς που εμφανίζουν συμπτώματα κλινικής αλλεργίας σε μία μορφή ASNase αλλάζουν σε άλλη μορφή για να εξασφαλίσουν ότι λαμβάνουν την πιο αποτελεσματική θεραπεία. Ωστόσο, στους ασθενείς με "σιωπηλή απενεργοποίηση", δεν υπάρχουν κλινικά συμπτώματα και, συνεπώς, δεν γίνεται αυτή η αλλαγή. Προς το παρόν, προκειμένου να μειωθούν εν μέρει οι παρενέργειες, στην αγορά κυκλοφορεί μια PEGylated μορφή της Ε. coli ASNase. Η PEG είναι η σύζευξη πρωτεϊνών με πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) και χρησιμοποιείται για να αυξήσει την ημιζωή ενός φαρμάκου αλλά και για να ενισχύσει τις ανοσολογικές του ιδιότητες μειώνοντας την ικανότητα παραγωγής αντισωμάτων. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, επειδή η ASNase παράγεται από βακτήρια, οι παρενέργειες είναι πολύ συχνές, κυρίως λόγω της δραστικότητας της L-γλουταμινάσης. Συνεπώς, υπάρχει μεγάλη ανάγκη να παράγεται ASNase με χαμηλή δραστικότητα γλουταμινάσης. Η ASNase από ευκαρυωτικές πηγές θεωρείται ότι μειώνει τις παρενέργειες και, εξελικτικά, οι ευκαρυωτικές πρωτεΐνες είναι πιο κοντά στις ανθρώπινες πρωτεΐνες. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει ότι οι ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί είναι ικανοί να παράγουν ASNase με χαμηλή ή ακόμη και χωρίς δραστικότητα L-γλουταμινάσης. Εκτός αυτού, οι Ε. coli και Ε. chrysanthemi ASNases παράγονται ενδοκυτταρικά. Σε αντίθεση με τα βακτήρια, οι περισσότεροι ευκαρυωτικοί μπορούν να παράγουν εξωκυτταρικά ASNase, γεγονός που καθιστά πολύ πιο εύκολη την ανάκτηση του τελικού προϊόντος, αλλά και οδηγεί σε υψηλότερες αποδόσεις. Η ανάκτηση και ο καθαρισμός των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών θεωρείται γενικά πολύπλοκη διαδικασία. Όσον αφορά το ακρυλαμίδιο, είναι μια πιθανώς καρκινογόνος ουσία που βρίσκεται κυρίως σε τροφές που περιέχουν δημητριακά και στις πατάτες. Δημιουργείται λόγω των αντιδράσεων Maillard, επίσης γνωστών ως μη ενζυμικό μαύρισμα, που λαμβάνουν χώρα συνήθως σε θερμοκρασίες άνω των 100 °C και είναι υπεύθυνες για το χρώμα και τη γεύση ψημένων και τηγανισμένων αμυλούχων τροφών. Η ποσότητα ακρυλαμιδίου σε αυτά τα τρόφιμα έχει αναφερθεί ότι κυμαίνεται από 30 έως 7500 μg/kg και επομένως η ASNase χρησιμοποιείται για να μειώσει την ποσότητα της. Χωρίς τη χορήγηση της ASNase, το αμινοξύ L-ασπαραγίνη αντιδρά με ένα αναγωγικό σάκχαρο, όπως η γλυκόζη, οδηγώντας στο σχηματισμό ακρυλαμιδίου. Όμως, παρουσία της ASNase, η ασπαραγίνη μετατρέπεται σε ασπαρτικό οξύ και αμμωνία. Εμπορικά, η ASNase έχει την ικανότητα να μειώνει τα επίπεδα ακρυλαμιδίου κατά 50% έως 90% χωρίς να αλλάζει τη γεύση και το χρώμα της τελικής ψημένης ή τηγανισμένης τροφής. Το κίνητρο αυτής της εργασίας ήταν να αναζητηθεί η παραγωγή της ASNase από ζυμομύκητες ως πιθανή εναλλακτική πηγή για να ληφθεί ένα προϊόν με λιγότερες παρενέργειες σε σύγκριση με τη βακτηριακή ASNase. Η δουλειά που έγινε εμπνεύστηκε από προηγούμενο φοιτητή, Ph.D Ignacio Moguel, που έδειξε παραγωγή ASNase στον Leucosporidium scottii με πολύ χαμηλή δράση γλουταμινάσης ταυτόχρονα με συσσώρευση λιπιδίων στη χαμηλή θερμοκρασία των 15 °C. Στην ουσία, το αντικείμενο αυτής της εργασίας ήταν να διερευνηθεί η παραγωγή ASNase από ελαιογόνους ζυμομύκητες (Lipomyces starkeyi, Saitoella coloradoensis, Rhodotorula glutinis, Rhosdosporidium toruloides, Yarrowia lipolytica) σε σύγκριση με το L. scottii. Πειράματα διεξήχθησαν σε φιάλες στους 15 °C χρησιμοποιώντας συνθετικό μέσο με γλυκόζη και γλυκερόλη ως πηγή άνθρακα και προλίνη ως πηγή αζώτου. Όλοι οι ζυμομύκητες εξετάστηκαν επίσης στους 30 °C για να ελεχθεί εάν η παραγωγή ASNase προκαλείται από χαμηλότερες θερμοκρασίες. Ο περισσότερα υποσχόμενος εξ αυτών δοκιμάστηκε στους 10 °C για να ελεγχθεί αν ακόμη χαμηλότερη θερμοκρασία ωφελεί την παραγωγή ASNase. Αργότερα, ο ίδιος μικροοργανισμός εξετάστηκε σε βιοαντιδραστήρα 1-L σε διαφορετικές συνθήκες αντιδραστήρα και διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις κυττάρων προκειμένου να γίνεται έλεγχος της παροχής οξυγόνου και άλλων παραμέτρων και να παρατηρηθεί πώς αυτές επηρεάζουν την παραγωγή ASNase. Επτά ελαιογόνοι ζυμομύκητες δοκιμάστηκαν για παραγωγή ASNase. Οι έξι (L. starkeyi NRRL Υ-1389, S. coloradoensis NRRL ΥΒ-2330, R. glutinis NRRL Υ-2502, R. toruloides NRRL Υ-1091, Y. lipolytica NRRL ΥΒ-567 και Y. lipolytica NRRL ΥΒ-392) προσφέρθηκαν από το Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Peoria-IL, USA ενώ ο L. scottii L115 ελήφθη από τη συλλογή καλλιεργειών του τμήματος βιοχημικής και βιοχημείας του UNESP (Rio Claro, Βραζιλία). Αυτό το στέλεχος απομονώθηκε από ένα θαλάσσιο ίζημα της Ανταρκτικής Χερσονήσου κατά τη διάρκεια των καλοκαιριών 2009 και 2010 από την Ομάδα Προγραμμάτων της Βραζιλιάνικης Ανταρκτικής. Οι καλλιέργειες σπόρων αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C σε 20% γλυκερόλη. Αναφορικά με τα πειράματα, η εργασία χωρίστηκε σε δύο μέρη. Στο πρώτο μέρος της εργασίας διεξήχθησαν πειράματα σε φιάλες των 500 mL χρησιμοποιώντας 150 mL μέσου στους 15°C, 250 rpm, με αρχική κυτταρική συγκέντρωση 5 g/L (ξηρή βάση). Επίσης δοκιμάστηκαν η συνήθης θερμοκρασία ανάπτυξης για τους περισσότερους ζυμομύκητες, 30°C, και χαμηλότερη θερμοκρασία, 10°C, για να εξεταστεί η επίδραση της θερμοκρασίας στην παραγωγή ASNase. Όλοι οι ζυμομύκητες δοκιμάστηκαν στους 15°C και στους 30°C και στη συνέχεια μόνο οι δύο επικρατέστεροι εξετάστηκαν περαιτέρω στους 10°C. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας έγιναν πειράματα σε βιοαντιδραστήρα 1L εξοπλισμένου με αυτόματες μονάδες παρακολούθησης και ελέγχου για τη θερμοκρασία, το pΗ/οξειδοαναγωγής, τον αερισμό και την ανάδευση. Το δοχείο του βιοαντιδραστήρα εξοπλίστηκε με δύο εξαπτέρυγους στροβίλους Rushton. Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν στους 15°C χρησιμοποιώντας την ίδια σύνθεση συνθετικού μέσου και την ίδια διαδικασία παρασκευής του εμβολίου όπως στις φιάλες ανάδευσης των 500 mL. Τα αποστειρωμένα διαλύματα πηγών άνθρακα (γλυκόζη και γλυκερόλη) προστέθηκαν χρησιμοποιώντας περισταλτική αντλία. Ο ανιχνευτής DO (διαλυμένου οξυγόνου) βαθμονομήθηκε όταν ο έλεγχος θερμοκρασίας σταθεροποιήθηκε στους 15°C, χρησιμοποιώντας το αέριο Ν2 ως μηδενικό σημείο και τον αέρα ως σημείο κλίσης. Ο εμβολιασμός έγινε με σύριγγα και για υψηλή συγκέντρωση κυττάρων με περισταλτική αντλία. Δύο διαφορετικές συνθήκες δοκιμάστηκαν στον βιοαντιδραστήρα. Η πρώτη ήταν η χρήση σταθερής kLa των 91,72 h-1, ανάδευση 325 rpm και 0,58 L/s αέρα. Η αρχική κυτταρική συγκέντρωση που εφαρμόστηκε σε αυτήν την περίπτωση ήταν 3, 5, 7 και 14 g/L. Η δεύτερη ήταν η χρήση σταθερού ποσοστού διαλυμένου οξυγόνου σε %DO=80% και σε αυτή την κατάσταση η συγκέντρωση εμβολίου ήταν 5 και 10 g/L. Η δραστικότητα της ASNase μετρήθηκε στο εξωκυττταρικό περιβάλλον και στο περιπλασμικό χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Nessler. Ανάμεσα στους επτά ζυμομύκητες, πέντε ήταν σε θέση να παράγουν περιπλασμική ASNase στους 15°C. Η ενεργότητα στο εξωκυτταρικό μέσο ήταν μηδενική. Συγκεκριμένα, οι L. scottii, R. toruloides, R. glutinis, S. coloradoensis και Y. lipolytica 392 παρήγαν ASNase. Αυτή είναι η πρώτη έρευνα που δείχνει την παραγωγή ASNase σε δύο εξ αυτών, τους S. coloradoensis και Y. lipolytica 392. Οι L. starkeyi και Y. lipolytica 567 δεν παρήγαγαν ASNase. Η κατανάλωση υποστρώματος (γλυκόζη και γλυκερόλη) κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας παρακολουθήθηκε με μέτρηση των ολικών διαλυτών στερεών με τη βοήθεια της ανάλυσης Brix και περαιτέρω και οι δύο ενώσεις ποσοτικοποιήθηκαν με ανάλυση HPLC. Το Brix (%) αναφέρεται σε μια κλίμακα μέτρησης των ολικών διαλυτών στερεών σε υγρό. Στην περίπτωση αυτή, τα διαλυτά στερεά είναι κυρίως σάκχαρα, επομένως η μέτρηση brix προσεγγίζει την περιεκτικότητα σε σάκχαρα του δείγματος. Το τεράστιο πλεονέκτημα της ανάλυσης brix είναι ότι δίνει άμεση προσέγγιση των σακχάρων, ενώ η HPLC απαιτεί πολύ περισσότερο χρόνο για τη ανάλυση. Ο L. scottii κατανάλωσε σάκχαρα με τον πιο αποτελεσματικό τρόπο σε σύγκριση με άλλους ζυμομύκητες αφού κατανάλωσε όλη τη γλυκόζη και σχεδόν όλη τη γλυκερόλη. Επιπλέον, οι L. starkeyi, R. toruloides και R. glutinis κατανάλωσαν σχεδόν όλη τη γλυκόζη εντός 96 ωρών. Ο S. colarodoensis, Υ. lipolytica 392 και Υ. lipolytica 567 δεν κατανάλωσαν σημαντικά τη γλυκόζη εντός 96 ωρών. Η γλυκερόλη καταναλώθηκε από όλες τις ζύμες, σε διαφορετικές ποσότητες. Η παραγωγικότητα (QP) μετρήθηκε για όλους τους ζυμομύκητες στις 96 ώρες εκτός από το Υ. lipolytica 392, η οποία υπολογίστηκε σε 72 ώρες λόγω απουσίας της δραστικότητας ASNase στις 96 ώρες. Ο R. glutinis έδειξε το υψηλότερο αποτέλεσμα στην παραγωγικότητα ASNase με τιμή 10,85 ± 0,61 U/(Lh). Το ενδιαφέρον εδώ είναι ότι ο S. coloradoensis, έδειξε την υψηλότερη απόδοση όσον αφορά το προϊόν ανά βιομάζα (YP/Χ, U/g κύτταρα) και κατανάλωσε σάκχαρα με τον λιγότερο αποτελεσματικό τρόπο. Αυτό σημαίνει ότι εάν βελτιωθεί το μέσο καλλιέργειας και οι συνθήκες, αυτός ο ζυμομύκητας θα μπορεί να καταναλώνει πιο αποτελεσματικά τα σάκχαρα και έτσι θα μπορεί να παράγει υψηλότερες ποσότητες του ενζύμου. Μετά από 96 ώρες, ο S. coloradoensis έδειξε την υψηλότερη απόδοση προϊόντος ανά κύτταρα (58,94 ± 9,28 U/g κύτταρα), κάτι που δείχνει τη μεγάλη δυνητικότητα αυτής της ζύμης για παραγωγή της ASNase. Ο S. coloradoensis έδειξε επίσης την υψηλότερη τιμή της απόδοσης προϊόντος ανά υπόστρωμα που καταναλώθηκε, ΥΡ/S=28,58±1,72 U/g υποστρώματος. Επομένως, ο πιο κατάλληλος για την παραγωγή ενζύμου ήταν ο S. coloradoensis, αφού είχε την υψηλότερη απόδοση προϊόντος προς βιομάζα 58.94±9.28 U/g κυττάρων μεταξύ των άλλων ζυμομυκήτων σε φιάλες των 500 mL στους 15 °C μετά από 96 ώρες καλλιέργειας. Συγκρίνοντας την παραγωγή ASNase από ζυμομύκητες και βακτήρια, η ενζυμική δραστικότητα (U/mL) στον Ε. coli κυμαίνεται από 32,7 U/mL έως 140,6 U/mL ανάλογα με το στέλεχος. Η ειδική ενζυμική δραστικότητα (U/mg πρωτεΐνης) στον Ε. coli κυμαίνεται από 100 έως 300 U/mg πρωτεΐνης και στον E. chrysanthemi μπορεί να είναι περίπου 70 U/mg πρωτεΐνης. Παρά το γεγονός ότι η ASNase που παράγεται από τους ζυμομύκητες που αξιολογήθηκαν στην παρούσα μελέτη δεν είναι αρκετά υψηλή σε σύγκριση με τα βακτήρια, υπάρχει ακόμα μεγάλο περιθώριο για βελτιστοποίηση στο συνθετικό μέσο και στις συνθήκες καλλιέργειας. Στη συνέχεια όλοι οι μικροοργανισμοί εξετάστηκαν στους 30 °C για να ελεγχθεί εάν η παραγωγή ASNase προκαλείται ή όχι από χαμηλές θερμοκρασίες. Από τους μικροοργανισμούς που μελετήθηκαν, μόνο οι L. starkeyi, R. toruloides και S. coloradoensis ήταν σε θέση να αναπτυχθούν στους 30 °C. Ωστόσο, κανένας από αυτούς δεν παρήγαγε ASNase σε αυτή τη θερμοκρασία. Αυτό δείχνει ότι η θερμοκρασία παίζει βασικό ρόλο στην παραγωγή ASNase από αυτούς τους ζυμομύκητες. Αυτό που είναι πραγματικά ενδιαφέρον είναι ότι οι ζυμομύκητες που παρήγαγαν ASNase στους 15 °C αλλά όχι στους 30 °C, παρήγαγαν περισσότερα λιπίδια στους 30 °C, σε σχέση με τους 15 °C. Η ποσοτικοποίηση των συνολικών λιπιδίων ήταν ένας τρόπος εξέτασης του μεταβολισμού. Ο R. toruloides παρήγαγε 0,31 ± 0,00 U/mL ενζύμου και 1,87 ± 0,06 mg/mL ολικών λιπιδίων στους 15 °C. Ωστόσο, στους 30 °C, δεν παρήγαγε ASNase, αλλά παρήγαγε πολύ περισσότερα λιπίδια 6,37 ± 0,32 mg/mL. Το ίδιο συνέβη και με το S. coloradoensis όπου παρήγαγε 0,57 ± 0,08 U / mL ASNase και 1,93 ± 0,05 mg / mL ολικών λιπιδίων στους 15 °C. Ωστόσο, στους 30 °C, δεν παρήγαγε ASNase, αλλά παρήγαγε περισσότερα λιπίδια 2,84 ± 0,05 mg/mL. Ο S. coloradoensis, αφού επιλέχθηκε ως ο περισσότερο υποσχόμενος για την παραγωγή ASNase, δοκιμάστηκε επίσης στους 10°C. Διαπιστώθηκε ότι μεταξύ των 10, 15, 30 °C, η θερμοκρασία των 15 °C επιλέχθηκε ως βέλτιστη θερμοκρασία για την παραγωγή ASNase στον S. coloradoensis. Ο S. coloradoensis εξετάστηκε στη συνέχεια στον βιοαντιδραστήρα 1-L, προκειμένου να γίνεται έλεγχος της παροχής οξυγόνου και άλλων παραμέτρων και να παρατηρηθεί πώς αυτές επηρεάζουν την παραγωγή ASNase. Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικές συνθήκες. Η πρώτη ήταν σταθερή kLa = 91,72 h-1 στην οποία δοκιμάστηκαν 4 διαφορετικές συγκεντρώσεις κυττάρων (3, 5, 7, 14 g/L) για να αναλυθεί η επίδραση στην παραγωγή ASNase στο βιοαντιδραστήρα. Η ποσότητα διαλυμένου οξυγόνου (%DO) ήταν σχεδόν μηδενική σε υψηλή αρχική κυτταρική συγκέντρωση (7 και 14 g/L) έως 120 ώρες καλλιέργειας. Για αρχική συγκέντρωση κυττάρων 3 και 5 g/L παρουσιάστηκαν διαφορετικές τιμές. Το %DO στα 3 g/L ξεκίνησε στο 60% και μετά ανέβηκε στο 75% εντός 24 ωρών και στη συνέχεια άρχισε να πέφτει μέχρι σχεδόν το μηδέν στις 120 ώρες και τελικά ανέβηκε και πάλι μέχρι το τέλος. Επίσης στα 5 g/L, το %DO παρουσίασε μία αύξηση στις 24 ώρες και 72 ώρες, στη συνέχεια μια πτώση σε σχεδόν μηδενικό %DO στις 96 ώρες και ανύψωση και πάλι από 120 ώρες μέχρι τις 144 ώρες. Όσον αφορά την παραγωγή ASNase, η ενεργότητα του ενζύμου ήταν υψηλότερη για τη χαμηλότερη αρχική συγκέντρωση κυττάρων (3 g/L), με μέγιστη τιμή 0,983 ± 0,014 U/mL μετά από 72 ώρες. Η αρχική υπόθεση ήταν ότι όσο υψηλότερη είναι η συγκέντρωση εμβολιασμού, τόσο υψηλότερη είναι η παραγωγή ASNase. Ωστόσο, αυτό δεν συνέβη εδώ, πιθανότατα επειδή η παροχή αέρα δεν ήταν αρκετή για τις υψηλότερες συγκεντρώσεις εμβολίου (7, 14 g/L). Η δραστικότητα ASNase έφτασε περίπου στην ίδια τιμή από 72 ώρες και μετά ανεξάρτητα από την αρχική συγκέντρωση κυττάρων. Η δεύτερη δοκιμή ήταν με σταθερό %DO=80%. Τα κύτταρα δεν αναπτύχθηκαν όσο όταν χρησιμοποιήθηκε η πρώτη συνθήκη (με σταθερή kLa). Αυτό συνέβη επειδή το %DO ήταν υψηλότερο, και έτσι τα κύτταρα έφτασαν στη στάσιμη φάση γρηγορότερα. Ξεκινώντας με συγκέντρωση κυττάρων 10 g/L, προέκυψε ελαφρώς υψηλότερη παραγωγή ASNase από 5 g/L. Συνεπώς, συμπεραίνεται ότι για σταθερό %DO=80%, όσο μεγαλύτερος είναι ο εμβολιασμός τόσο μεγαλύτερη είναι η παραγωγή της ASNase. Η παραγωγή ASNase είναι υψηλότερη όταν τα κύτταρα εισέρχονται στη στάσιμη φάση. Αυτό σημαίνει ότι τα κύτταρα αναπτύχθηκαν αρχικά λόγω της πηγής άνθρακα και αζώτου, αλλά όταν αυτές εξαντλήθηκαν, η παραγωγή ενζύμου αυξήθηκε με την ενεργοποίηση των γονιδίων επιβίωσης. Γενικά, μεταξύ των δύο (σταθερή kLa = 91,72 h-1 και σταθερό %DO=80%) και διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις κυττάρων, η ενζυμική ενεργότητα ήταν παρόμοια (περίπου 0,830 ± 0,054 U/ mL) που σημαίνει ότι περαιτέρω έρευνα είναι απαραίτητη για να βρεθεί η απαίτηση σε οξυγόνο για βέλτιστη παραγωγή ενζύμου. Η υψηλότερη απόδοση προϊόντος προς βιομάζα παρουσιάστηκε για 5 g/L και σταθερό %DO με τιμή 150,86 ± 34,10 U/g κύτταρα. Η μεταφορά από φιάλες των 500 mL σε βιοαντιδραστήρα 1-L έπαιξε σημαντικό ρόλο στην παραγωγή ASNase, αφού η παραγωγικότητα έδειξε αύξηση 50,9%, από 6,07 ± 0,00 σε φιάλες σε 9,16 ± 0,10 U/(L.h) σε βιοαντιδραστήρα χρησιμοποιώντας 3 g/L ως αρχική συγκέντρωση κυττάρων και σταθερά kLa. Τέλος, αυτό που είχε πάρα πολύ ενδιαφέρον είναι η μέτρηση της δραστικότητας της γλουταμινάσης. Η δραστικότητα γλουταμινάσης έχει συσχετιστεί με πολλές παρενέργειες στους ασθενείς και ο αρχικός στόχος ήταν να παραχθεί ASNase σε ζυμομύκητες επειδή υποστηρίζεται ότι οι ευκαρυώτες είναι ικανοί να παράγουν ASNase με πολύ χαμηλά ποσοστά ενεργότητας GLNase. Η δραστικότητα GLNase (U/mL) ήταν πραγματικά χαμηλή σε σύγκριση με τη δραστηριότητα ASNase. Αυτό συνεπώς δείχνει ότι ο S. coloradoensis μπορεί να αποτελέσει μία εναλλακτική πηγή ASNase. | el |
heal.abstract | L-asparaginase (ASNase) is a key therapeutic agent for the treatment of different types of cancer. Commercially, ASNase is produced by bacteria which leads to many severe side effects to the patients, such as hyperglycaemia, acute pancreatitis, hepatotoxicity. Therefore, production of ASNase from alternative sources, such as eukaryotic microorganisms, has gathered a lot of attention. Thus, in the present study, a screening of seven different yeasts was conducted to find out potential producers of ASNase. A temperature of 15 °C as stressful condition was initially tested. From the seven yeasts, five of them were able to produce ASNase. Among these, this is the first report showing ASNase production in S. coloradoensis and Y. lipolytica 392. The best candidate for the enzyme production was S. coloradoensis since it showed the highest product to biomass yield 58.94 ± 9.28 U/g of cells among the other yeasts in 500 mL flasks at 15°C after 96 hours of cultivation. Among 10, 15, 30 °C, the temperature of 15°C was chosen as optimum temperature for ASNase production. A total lipids analysis was conducted in order to investigate where the metabolism “goes”. Yeasts that were able to produce ASNase at 15°C and not at 30°C, produced more lipids at 30 °C than at 15 °C. Since S. coloradoensis was selected as the most prominent candidate, it was tested in 1-L bioreactor. Among the two different experimental conditions that were used (constant kLa of 91.72 h-1 and cascade control of 80% oxygen saturation) and different inoculum concentrations the results were similar (0.830 ± 0.054 ASNase U/ mL) suggesting that more studies are necessary to optimize its production, for example determine the requirement of oxygen for maximum ASNase production as well the productivity and yield. The highest product to biomass yield was shown for 5 g/L and cascade control of 80 % oxygen saturation with a value of 150.86 ± 34.10 U/g cells. The transfer from 500 mL flasks to 1-L bioreactor played a significant role in the enzyme production since the productivity increased by 50.9 %, from 6.07 ± 0.00 U/ (L.h) in flasks to 9.16 ± 0.10 U/ (L.h) in bioreactor using 3 g/L as initial inoculum concentration in both cases. Concerning the glutaminase (GLNase) activity, which is an important cause of side-effects, it was really low compared to the ASNase activity and in the case of 7 g/L inoculum and constant kLa, there was no GLNase activity. That justifies the hypothesis that the eukaryotic microorganisms can produce ASNase with really low GLNase activity and can be a suitable commercial producer of an enzyme that will lessen the side effects to the patients. | en |
heal.advisorName | Τόπακας, Ευάγγελος | el |
heal.committeeMemberName | Τόπακας, Ευάγγελος | el |
heal.committeeMemberName | Κέκος, Δημήτριος | el |
heal.committeeMemberName | Μοροπούλου, Αντωνία | el |
heal.academicPublisher | Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV) | el |
heal.academicPublisherID | ntua | |
heal.numberOfPages | 80 σ. | |
heal.fullTextAvailability | true |
Οι παρακάτω άδειες σχετίζονται με αυτό το τεκμήριο: