Ανάπτυξη διαγνωστικής μεθόδου για την ανίχνευση ιικών λοιμώξεων μέσω του μηχανισμού Toehold Switch

Λιτσα, Μαρία; Litsa, Maria

dc.contributor.author	Λιτσα, Μαρία	el
dc.contributor.author	Litsa, Maria	en
dc.date.accessioned	2020-01-20T10:09:55Z
dc.date.available	2020-01-20T10:09:55Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/49675
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.17373
dc.rights	Default License
dc.subject	Toehold Switch	en
dc.subject	MERS-CoV	en
dc.subject	Gibson assembly	en
dc.subject	Restriction free cloning	en
dc.subject	Trehalase	en
dc.subject	Leucine zippers	en
dc.title	Ανάπτυξη διαγνωστικής μεθόδου για την ανίχνευση ιικών λοιμώξεων μέσω του μηχανισμού Toehold Switch	el
dc.title	Development of a diagnostic method for the detection of infectious diseases based on the Toehold Switch mechanism	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Συνθετική Βιολογία, Διαγνωστική	el
heal.classification	Synthetic Biology, Diagnostics	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2019-07-01
heal.abstract	Middle-East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) is a virus with ~35% mortality rate, considered to be one of the most likely to cause major epidemics. The aim of the present diploma thesis is the development of a novel method for the detection of MERS-CoV. The engineered method is based on the toehold switch mechanism. Toehold switches are mRNA molecules with riboswitch functionality. In this case, the designed switches regulate the expression of trehalase, an enzyme which hydrolyzes the disaccharide trehalose to glucose and acts as the reporter of the system. Trehalase expression is allowed only when the virus is present in the sample. Thus, overall, the viral load in the sample triggers glucose production, which is measured by a common commercial glucometer, signaling the diagnosis. An alternative reporter system, an engineered split trehalase, was also proposed. This system lowers the structural complexity of the toehold switches, which is considered to accelerate the diagnosis. The two split fragments assemble to a functional enzyme through leucine zipper interactions. Nevertheless, the reassembly of the enzyme was not experimentally tested. In the frame of this diploma thesis, every single toehold switch for the specific detection of MERS-CoV was designed in silico and the four ones presenting optimum thermodynamic profiles where chosen for in vitro testing of their functionality. For the construction of the molecular mechanism, we chose to use two novel cloning techniques, widely used in the field of synthetic biology; Gibson Assembly and Restriction Free Cloning. Gibson Assembly was utilized for the cloning process of the toehold switches and Restriction Free Cloning cloning was used for the cloning process of the trigger RNAs. The success of the cloning processes was validated through DNA sequencing. We proved that the tested toehold switches were able to repress the translation of the reporter protein in their ON state (toehold structure). However, in the presence of their corresponding trigger RNAs, the switches did not transition to their OFF state (linear structure). Finally, simulating a toehold switch on its OFF state, we demonstrated that the proposed diagnostic mechanism demands about 69 minutes of reaction time in order to give the final diagnosis signal.	en
heal.abstract	Ο Middle-East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) είναι ένας ιός με ποσοστό θνησιμότητας ~35%, που θεωρείται ένας από τους πιο πιθανούς υπεύθυνους για πρόκληση μελλοντικής επιδημίας. Ο στόχος της συγκεκριμένης διπλωματικής εργασίας είναι η ανάπτυξη μίας καινοτόμου μεθόδου για την ανίχνευση του MERS-CoV. Η μέθοδος που προτείνεται στην εργασία βασίζεται στο μηχανισμό των ριβοδιακοπτών φουρκέτας (toehold switches). Τα toehold switches είναι μόρια mRNA με λειτουργία ριβοδιακόπτη. Εν προκειμένω, οι ριβοδιακόπτες που σχεδιάστηκαν ρυθμίζουν την έκφραση της τρεχαλάσης, ενός ενζύμου που υδρολύει το δισακχαρίτη τρεχαλόζη σε γλυκόζη και λειτουργεί ως ο μάρτυρας του συστήματος. Η έκφραση της τρεχαλάσης επιτρέπεται μόνο όταν ο ιός είναι παρών στο δείγμα. Έτσι συνολικά, το ιικό φορτίο στο δείγμα ενεργοποιεί την παραγωγή γλυκόζης, η οποία ποσοτικοποιείται μέσω ενός συμβατικού εμπορικού μετρητή σακχάρου, σημαίνοντας τη διάγνωση. Ως εναλλακτικό σύστημα μάρτυρα, προτείνεται επίσης η κλασμάτωση της τρεχαλάσης σε δύο τμήματα. Αυτό το σύστημα μειώνει τη δομική πολυπλοκότητα των toehold switches και αναμένεται να μειώσει τον απαιτούμενο χρόνο για διάγνωση. Τα δύο τμήματα ενώνονται μεταξύ τους δομώντας το λειτουργικό ένζυμο μέσω αλληλεπιδράσεων φερμουάρ λευκίνης. Αυτή η επανένωση ωστόσο δεν ελέγχθηκε πειραματικά. Στο πλαίσιο αυτής της διπλωματικής εργασίας, σχεδιάστηκε in silico κάθε πιθανό toehold switch για την ειδική ανίχνευση του MERS-CoV και τα τέσσερα εξ αυτών που παρουσίασαν βέλτιστο θερμοδυναμικό προφίλ επιλέχθηκαν για in vitro έλεγχο της λειτουργικότητάς τους. Για την κατασκευή του μοριακού μηχανισμού, επιλέχθηκαν δύο καινοτόμες μέθοδοι κλωνοποίησης, ευρέως χρησιμοποιούμενες στον τομέα της συνθετικής βιολογίας – το Gibson Assembly και το Restriction Free Cloning. Η πρώτη μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την κλωνοποίηση των toehold switches και η δεύτερη για την κλωνοποίηση των trigger RNAs. Η επιτυχία των δύο μεθόδων επιβεβαιώθηκε μέσω αλληλούχισης DNA. Απεδείχθη πως τα toehold switches που ελέγχθηκαν κατόρθωσαν να καταστείλουν τη μετάφραση της πρωτεΐνης-μάρτυρα στην ON κατάστασή τους. Ωστόσο, παρουσία του αντίστοιχου trigger RNA τους, δε μεταβήκαν στην κατάσταση OFF. Τέλος, προσομοιώνοντας τη συμπεριφορά ενός toehold switch σε κατάσταση OFF, δείξαμε πως ο προτεινόμενος διαγνωστικός μηχανισμός απαιτεί περίπου 69 λεπτά ώστε να δώσει το σήμα της τελικής διάγνωσης.	el
heal.advisorName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Kekos, Dimitrios	en
heal.committeeMemberName	Bakolas, Asterios	en
heal.committeeMemberName	Topakas, Evangelos	en
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.fullTextAvailability	true