Ανακάλυψη καινοτόμων βιοκαταλυτών μυκητιακής προέλευσης και εφαρμογή τους στη βιοεξυγίανση χλωριωμένων αρωματικών ρύπων

Abstract

Η παρούσα διδακτορική διατριβή στόχευσε στην ανακάλυψη και τροποποίηση βιοκαταλυτών με εφαρμογή στη βιοεξυγίανση χλωριωμένων αρωματικών ρύπων. Για την επίτευξη του στόχου αυτού ακολουθήθηκαν δύο μέθοδοι. Η μία βασίζεται στην εκμετάλλευση μικροοργανισμών που προέρχονται από ελάχιστα μελετημένα οικοσυστήματα και στη μελέτη των μηχανισμών με τους οποίους αυτοί αποτοξικοποιούν ξενοβιοτικά. Η δεύτερη μέθοδος βασίζεται στην in silico αναζήτηση και ανακάλυψη πρωτεϊνικών αλληλουχιών με πιθανότητα δράσης σε αρωματικούς ρύπους και η τροποποίηση των ενζύμων αυτών με εργαλεία πρωτεϊνικής μηχανικής, για τη βελτίωση των ιδιοτήτων τους. Η έρευνα αυτή εμπίπτει τόσο στο πεδίο της Περιβαλλοντικής Βιοτεχνολογίας και στο πεδίο της Βιοκατάλυσης. Στο πρώτο κομμάτι της διατριβής μελετήθηκε το δυναμικό 104 μυκητιακών στελεχών για τη βιομετατροπή δύο χλωριωμένων αρωματικών ρύπων, της 2,4-διχλωροφαινόλης (2,4-DCP) και του 2,4,5-τριχλωροδιφαινυλίου (PCB29). Οι μύκητες αυτοί είχαν απομονωθεί ως συμβιώτες θαλάσσιων ασπόνδυλων, τα οποία είχαν συλλεχθεί από διαφορετικές περιοχές του κόσμου και διαφορετικά βάθη. Από τα στελέχη αυτά, 9 έδειξαν υψηλή δυνατότητα απομάκρυνσης 1 mM 2,4-DCP, σε ποσοστά υψηλότερα του 55%. Τα στελέχη αυτά ανήκαν στα γένη Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium, Cladosporium και Tritirachium. Η ανάλυση μεταβολιτών των στελεχών αυτών αποκάλυψε πολλούς μεταβολίτες, κάποιοι εκ των οποίων αναφέρονται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία, όπως τα συζεύγματα της 2,4-DCP με γλουταμίνη και κυστεΐνη, καθώς επίσης και ο παλμιτικός εστέρας της διχλωροκατεχόλης και η θειωμένη χλωροφαινόλη. Σε κάθε περίπτωση όλοι οι μεταβολίτες ήταν λιγότερο τοξικοί από την αρχική ένωση. Τα περισσότερα στελέχη μπόρεσαν να αποχλωριώσουν μερικώς ή πλήρως το ρύπο παράγοντας υδροξυκινόλη. Μάλιστα, το στέλεχος Tritirachium είχε τη δυνατότητα να πραγματοποιεί διάνοιξη του βενζολικoύ δακτυλίου, με την έκφραση ενός ενζύμου με δράση 1,2-διοξυγενάσης της κατεχόλης (C12O), παράγοντας υδροξυ-μουκονικό οξύ, αφομοιώνοντας πρακτικά το ρύπο. Το ένζυμο με ενεργότητα C12O απομονώθηκε από το εξωκυτταρικό υγρό του μύκητα και χαρακτηρίστηκε βιοχημικά, παρουσιάζοντας πολύ ενδιαφέροντα χαρακτηριστικά. Κατά την πρωτεομική ανάλυση, αποκαλύφθηκε ότι το ένζυμο αυτό είναι στην πραγματικότητα καταλάση με δράση C12O. Η διπλή αυτή καταλυτική δράση αναφέρεται για πρώτη φορά στη παγκόσμια βιβλιογραφία. Επίσης, ως C12O, το ένζυμο αυτό μπορούσε να διασπάσει και την 4-χλωροκατεχόλη εκτός από την κατεχόλη και την υδροξυκινόλη, γεγονός που το κάνει πολύ ελκυστικό σε εφαρμογές βιοεξυγίανσης. Στη συνέχεια της έρευνας αναφορικά με τους θαλάσσια προερχόμενους μύκητες, μελετήθηκε η δυνατότητά τους να απομακρύνουν το PCB29 σε διαλύματα κορεσμένα με το ρύπο. Από τα 104 στελέχη, 8 κατάφεραν να απομακρύνουν το ρύπο σχεδόν εξολοκλήρου (>98.5%), τα οποία ανήκαν στα γένη Penicillium, Aspergillus, Purpureocillium, Cladosporium και Alternaria. Κατά τη διαδικασία απομάκρυνσης του ρύπου, κανένα από τα μελετούμενα στελέχη δεν εξέφραζε ενεργότητες διοξυγενασών του 2,3-διυδροξυ-διφαινυλίου, διοξυγενασών της κατεχόλης ή αφαλογoνάσης των αλκανίων. Ένα, όμως, στέλεχος Cladosporium εξέφραζε ενεργότητα λακκάσης σε επίπεδα πολύ υψηλότερα από τα υπόλοιπα στελέχη. Από το εξωκυτταρικό υγρό του στελέχους αυτού, πραγματοποιήθηκε απομόνωση δύο ισοενζύμων λακκάσης, ύστερα από καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου 12 L. Τα ένζυμα αυτά παρουσίασαν παρόμοια βιοχημικά χαρακτηριστικά, αναφορικά με τις βέλτιστες συνθήκες δράσης τους και το εύρος των υποστρωμάτων που μπορούν να οξειδώσουν. Το ένα από τα δύο όμως παρουσίασε τη δυνατότητα απομάκρυνσης του PCB29 σε ποσοστό 71% σε αντιδράσεις παρουσία μεσολαβητή. Στο δεύτερο τμήμα της διατριβής πραγματοποιήθηκε η in silico ανακάλυψη, κλωνοποίηση και έκφραση ενός γονιδίου πολυφαινολοξειδάσης (PPO) από τoν μύκητα Thermothelomyces thermophila στο ετερόλογο σύστημα Pichia pastoris. Ύστερα από εκτενή βιοχημικό χαρακτηρισμό του απομονωμένου ενζύμου, δοκιμάστηκε η χρήση του στην απομάκρυνση διαφόρων μονο- και δι-χλωροφαινολών. Με στόχο τόσο τη μελέτη της επίδρασης συγκεκριμένων αμινοξέων στην στερεοεκλεκτικότητα του ενζύμου, όσο και την αύξηση της καταλυτικής του ενεργότητας σε διχλωροφαινόλες, πραγματοποιήθηκε η τροποποίησή του με σημειακές μεταλλάξεις. Από τα πέντε τροποποιημένα ένζυμα που κατασκευάστηκαν, στο ένα η ενεργότητα στην οξείδωση της 3,5-DCP πενταπλασιάστηκε με μόνο δύο μεταλλάξεις.