Ανάπτυξη βιοαισθητήρα για την ταχεία ανίχνευση ορμονών και τοξινών με εφαρμογή σε τρόφιμα και ύδατα

Abstract

Οι πρόσφατες εξελίξεις στους τομείς της βιοαναλυτικής χημείας και της μικροηλεκτρονικής οδήγησαν σε μια αυξανόμενη τάση μεταφοράς των κλασσικών αναλυτικών μεθόδων από τον εργαστηριακό πάγκο, στο πεδίο, μέσω της ανάπτυξης φορητών συσκευών ή μικροσυστημάτων βασισμένων σε βιοαισθητήρες. Οι βιοαισθητήρες είναι αυτοτελείς ενσωματωμένες συσκευές συνήθως σε μεγαλύτερα αναλυτικά όργανα, ικανές να παρέχουν αναλυτικές πληροφορίες χρησιμοποιώντας μόρια βιολογικής αναγνώρισης σε άμεση χωρική επαφή με μεταλλάκτη. Οι πληροφορίες που δίνουν μπορούν να κυμαίνονται από τη συγκέντρωση ενός συγκεκριμένου συστατικού δείγματος έως την ολική ανάλυση της σύνθεσης. Οι φυτικές ορμόνες (αυξίνες) εμπλέκονται στην πλειονότητα των διαδικασιών που συνδέονται με την ανάπτυξη των φυτών, την κατάλληλη εξέλιξη και αναπαραγωγή. Μεταξύ των φυτικών ορμονών που προσελκύουν ιδιαίτερη προσοχή και αποτελούν το αντικείμενο εκτεταμένων μελετών, η ειδική θέση ανήκει στο Ινδολο-3-Οξικό Οξύ (IAA) που είναι η κύρια φυσική αυξίνη και το παράγωγο της Ναφθαλενικό Οξικό Οξύ (NAA). Οι θαλάσσιες νευροτοξίνες είναι φυσικά προϊόντα που παράγονται κυρίως από φυτοπλαγκτόν μαζί με διάφορους τύπους ασπόνδυλων και επιλεγμένα είδη ψαριών. Η Σαξιτοξίνη (STX) είναι μια ισχυρή νευροτοξίνη και η πιο γνωστή παραλυτική τοξίνη οστρακοειδών (PST). Η κατάποση Σαξιτοξίνης συνήθως με την κατανάλωση οστρακοειδών μολυσμένων από τοξικές ανθοφόρες φυλές, είναι υπεύθυνη για την ασθένεια, γνωστή ως παραλυτική δηλητηρίαση οστρακοειδών. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε κατ' αρχήν ένας πρότυπος ηλεκτροχημικός βιοαισθητήρας για τον προσδιορισμό της συνθετικής φυτικής ορμόνης του Ναφθαλενικού Οξικού Οξέος (NAA) σε φρούτα και λαχανικά. Αυτός ο βιοαισθητήρας κατασκευάστηκε με εναπόθεση νανόφυλλων γραφενίου πάνω σε σύρμα χαλκού (d = 0,25 mm) τοποθετημένου επί ενός φίλτρου από υαλώδεις ίνες και ακινητοποιημένη λιπιδική μεμβράνη με ενσωματωμένους τους υποδοχείς δέσμευσης της πρωτεΐνης- αυξίνης (ΑΒΡ1) για τον προσδιορισμό του ΝNA. Χρησιμοποιήθηκε το σύστημα έγχυσης ροής (flowinjection) με ρυθμό προσθήκης 2 mL / min από υδατικά διαλύματα ΝΝΑ των 10 και 20 mL. Η απόκριση του αισθητήρα σε διάφορες συγκεντρώσεις NAA, βρέθηκε να παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία (~56 mV/ δεκάδα συγκεντρώσεων) για μια ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων του ΝΑΑ που κυμαινόταν από 50x10-9 M έως 10x10-6 M. Το πλέον κατάλληλο περιβάλλον για να γίνουν οι μετρήσεις βρέθηκε να είναι σε pH=7. Στον προτεινόμενο βιοαισθητήρα έγινε έλεγχος αναγεννησιμότητας με ρυθμό ροής 2,0 mL/6 λεπτά με 10 επιτυχείς αναγεννήσεις. Το όριο ανίχνευσης, με βάση τη χαμηλότερη συγκέντρωση που θα μπορούσε να μετρηθεί αξιόπιστα προσδιορίστηκε σε (LOD= 10 nΜ) και (LΟQ=14 nM). O έλεγχος του βιοαισθητήρα σε πρότυπα διαλύματα ΝΑΑ συγκέντρωσης 7x10-7 Μ έγινε με την παρουσία συνηθισμένων παρεμποδιστών που απαντώνται σε φρούτα και λαχανικά, χωρίς να παρατηρηθούν σημαντικές μεταβολές στο σήμα του ΝΑΑ. Στη συνέχεια έγινε αξιολόγηση / επικύρωση αυτού του βιοαισθητήρα με τη χρήση 36 δειγμάτων φρούτων και λαχανικών. Οι ανακτήσεις στα δείγματα αυτά κυμάνθηκαν μεταξύ 91-106 % και για τα χαμηλά και υψηλά επίπεδα NAA. Η συσκευή μπορεί να κατασκευαστεί πολύ εύκολα, έχει εξαιρετικά αναπαραγώγιμα αποτελέσματα και μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί πολλές φορές. Η παρούσα τεχνολογία μπορεί να προσαρμοστεί για την ανίχνευση άλλων ορμονών σε φρούτα και λαχανικά.‘Oταν η συγκέντρωση του NAA βρίσκεται πάνω από το θεσμοθετημένο όριο των 0.07 mg/Kg σωματικού βάρους/ημέρα είναι επιβλαβής και προκαλεί οξεία τοξικότητα, ερεθισμό του αναπνευστικού συστήματος και οφθαλμικές βλάβες (EnvironmentalProtectionAgency: case 0379, 2007; Οδηγία 91/414 ΕΟΚ; Κανονισμός 546/2011). Στη συνέχεια αναπτύχθηκε ένας μικροσκοπικός ποτενσιομετρικός βιοαισθητήρας για την ανίχνευση Σαξιτοξίνης (STX) χρησιμοποιώντας έγχυση ροής με ρυθμό προσθήκης 2 mL / min για υδατικά διαλύματα STX των 10-20 μL. Ο βιοαισθητήρας αυτός παρασκευάστηκε, όπως προηγουμένως για το ΝΑΑ, με εναπόθεση σε σύρμα χαλκού στοιβάδων γραφενίου σε φίλτρο από υαλώδεις ίνες με ενσωματωμένες λιπιδικές μεμβράνες και η αντι-STX (ο φυσικός υποδοχέας σαξιτοξίνης) ακινητοποιημένη στις σταθεροποιημένες λιπιδικές μεμβράνες. Η απόκριση του βιοαισθητήρα σε διάφορες συγκεντρώσεις της σαξιτοξίνης, βρέθηκε να παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία (~60 mV/ δεκάδα συγκεντρώσεων) για μια ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων της τοξίνης που κυμαινόταν από 1 Χ 10-9 Μ έως 1 Χ 10-6 Μ σε pH=7. Στον προτεινόμενο βιοαισθητήρα έγινε έλεγχος αναγεννησιμότητας με βέλτιστη τιμή συνεχούς ροής 2,0 mL/λεπτό για 10 λεπτά με 10 επιτυχείς αναγεννήσεις (διατήρηση της αρχικής δραστικότητάς του).Ο έλεγχος του βιοαισθητήρα σε προσομοιωμένα δείγματα νερών λίμνης ήταν επιτυχής και δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές υπό την επίδραση επτά συνηθισμένων παρεμποδιστών σε τρία επίπεδα συγκέντρωσης (χαμηλό, μεσαίο και υψηλό) που εισήχθησαν σε εμβολιασμένα με STX πρότυπα δείγματα. Ακολούθησε μελέτη του βιοαισθητήρα σε 10 δείγματα πραγματικού νερού λίμνης και υπολογίστηκε το ποσοστό ανάκτησης της τοξίνης 90-106% για τη χαμηλή συγκέντρωση (50 nM) και 95-102% για την υψηλή συγκέντρωση (1 μM). Το όριο ανίχνευσης προσδιορίστηκε με βάση τη χαμηλότερη συγκέντρωση που μπορεί να μετρηθεί αξιόπιστα (S/N=3) και βρέθηκε (LOD=1nM), ενώ το όριο ποσοτικοποίησης βρέθηκε (LOQ=3nM).Το όριο ανίχνευσης του βιοαισθητήρα είναι κάτω από το επιτρεπόμενο όριο τιμών (80 μg/100 σάρκας οστρακοειδών) που έχει ορίσει η Ευρωπαϊκή Αρχή για την Ασφάλεια των Τροφίμων [TheEFSAJournal 1019, 1-7, (2009)] γεγονός που καθιστά το βιοαισθητήρα κατάλληλο για την ανίχνευση της Σαξιτοξίνης. Η καταλληλότητα του αισθητήρα που αναπτύξαμε επαληθεύθηκε περαιτέρω σε δείγματα νερού λίμνης εμβολιασμένα με STX και σε δείγματα νωπών οστρακοειδών.