Απομόνωση και χαρακτηρισμός μιας α-αμυλάσης από το μύκητα Paecilomyces variotii

Αποστολίδη, Μυρτώ Ελβίρα; Apostolidi, Myrto Elvira

dc.contributor.author	Αποστολίδη, Μυρτώ Ελβίρα	el
dc.contributor.author	Apostolidi, Myrto Elvira	en
dc.date.accessioned	2020-03-30T14:38:21Z
dc.date.available	2020-03-30T14:38:21Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/49970
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.17668
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Α-αμυλάση	el
dc.subject	Ένζυμα	el
dc.subject	Απομόνωση	el
dc.subject	Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής	el
dc.subject	Χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή	el
dc.subject	Alpha amylase	en
dc.subject	Enzymes	en
dc.subject	Anion exchange chromatography	en
dc.subject	Purification	en
dc.subject	Gel filtration chromatography	en
dc.title	Απομόνωση και χαρακτηρισμός μιας α-αμυλάσης από το μύκητα Paecilomyces variotii	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	campus
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2019-07-01
heal.abstract	Στην παρούσα διπλωματική εργασία απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε μια α-αμυλάση από τον μύκητα Paecilomyces variotii. Η αερόβια ανάπτυξη του μικροοργανισμού πραγματοποιήθηκε σε βυθισμένη ζύμωση και ως πηγή άνθρακα επιλέχθηκε το πίτυρο σίτου (wheat bran). Η απομόνωση της α-αμυλάσης πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας αρχικά καταβύθιση των πρωτεϊνών με θειικό αμμώνιο και στη συνέχεια χρωματογραφικές τεχνικές, συγκεκριμένα χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής και χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή. Η διαδικασία απομόνωσης οδήγησε σε ανάκτηση του 20.2% του αρχικού ενζύμου. Ακολούθησε μελέτη των ιδιοτήτων του καθαρού ενζύμου, η οποία περιελάμβανε την εύρεση του μοριακού του βάρους, των συνθηκών pH και θερμοκρασίας που επηρεάζουν τη σταθερότητα και δράση του ενζύμου, την εύρεση των κινητικών σταθερών, την μελέτη της επίδρασης ιόντων μετάλλων στη δράση του ενζύμου και τη διερεύνηση των προϊόντων υδρόλυσης της α-αμυλάσης.Το μοριακό βάρος της α-αμυλάσης προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και βρέθηκε ίσο με 75 kDa. Ακόμη, υπολογίστηκαν οι κινητικές σταθερές Km και Vmax με υπόστρωμα το άμυλο. Οι τιμές των σταθερών βρέθηκαν 1.41 g/L και 58.45 μmole/mg protein/min, αντίστοιχα. H τιμή του αριθμού μετατροπής kcat βρέθηκε ίση με 73058 sec-1. Η βέλτιστη τιμή pH είναι 5.0 και η βέλτιστη θερμοκρασία για την δράση του ενζύμου είναι 60oC. Η ενέργεια ενεργοποίησης του ενζύμου (Εa) βρέθηκε ίση με 10.68 kJ.mol -1. Με τη βοήθεια των υπολογισθέντων τιμών του αριθμού μετατροπής kcat και της ενέργειας ενεργοποίησης Εa υπολογίσθηκαν οι μεταβολές των θερμοδυναμικών μεγεθών, ενθαλπία (ΔΗ), εντροπία (ΔS) και ελεύθερη ενέργεια Gibbs (ΔG) κατά την υδρόλυση του αμύλου, καθώς και το θερμοκρασιακό πηλίκο Q10. Το ένζυμο διατηρεί το 80% της ενεργότητάς του κατά την επώασή του σε pH 4.0-6.0 στους 4oC για 24 ώρες. Στους 30 oC, 40 oC και 50 oC η α-αμυλάση διατηρεί το 73%, 70% και 45% της ενεργότητάς της αντίστοιχα μετά από 400 min παραμονής στην κάθε θερμοκρασία. Στους 60 oC το ένζυμο απενεργοποιείται πλήρως μετά από 100 λεπτά παραμονής, στους 70oC μετά από 12 λεπτά και στους 80oC μετά από 10 λεπτά. Η ενέργεια θερμικής απενεργοποίησης (E(a)d) βρέθηκε ίση με 89.84 kJ.mol-1. Οι χρόνοι ημίσειας ζωής του ενζύμου στους 70 και 80°C υπολογίσθηκαν ίσοι με 3.3 και 2.7 min, αντίστοιχα, ενώ στους 50oC και 60oC βρέθηκαν ίσοι με 77.9 και 40.5 min. Οι τιμές των χρόνων υποδεκαπλασιασμού (D-value) στους 70°C και 80°C έδειξαν ότι προκειμένου να μειωθεί η αρχική ενεργότητα της α-αμυλάσης κατά 90% απαιτούνται 11.0 και 8.9 min, αντίστοιχα. Η τιμή ΖΤ βρέθηκε ίση με 22.6οC. Με τη βοήθεια των υπολογισθέντων τιμών της ενέργειας θερμικής απενεργοποίησης (E(a)d) και των σταθερών θερμικής απενεργοποίησης (kd) υπολογίσθηκαν οι μεταβολές των θερμοδυναμικών μεγεθών, ενθαλπία (ΔΗ), εντροπία (ΔS) και ελεύθερη ενέργεια Gibbs (ΔG) κατά τη θερμική απενεργοποίηση της α- αμυλάσης.Mελετήθηκε η επίδραση των ιόντων Ca2+, K+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Fe3+, Fe2+, Cu2+ και Co2+ και του χηλικού παράγοντα EDTA στη δράση του ενζύμου σε συγκεντρώσεις 1 mM και 5 mM του κάθε ιόντος και παρατηρήθηκε πως το ασβέστιο ενεργοποιεί το ένζυμο σε κάθε περίπτωση, το μαγγάνιο και ο δισθενής σίδηρος έχουν θετική επίδραση στα 1mM/60min και 1mM/30min αντίστοιχα, ενώ όλα τα υπόλοιπα ιόντα έχουν ανασταλτική δράση. Το EDTA έδρασε επίσης ανασταλτικά, γεγονός που φανερώνει πως η α-αμυλάση είναι μεταλλοένζυμο. Τέλος τα προϊόντα υδρόλυσης των υποστρωμάτων άμυλο, αμυλόζη, αμυλοπηκτίνη και μαλτόζη ταυτοποιήθηκαν με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC). Τα προϊόντα που σχηματίστηκαν με υπόστρωμα το άμυλο, την αμυλόζη και την αμυλοπηκτίνη ήταν μαλτοολιγοσακχαρίτες όπως η μαλτόζη και η μαλτοτριόζη, ενώ η μαλτόζη δεν υδρολύθηκε.	el
heal.abstract	In the present thesis, an α-amylase produced by the fungus Paecilomyces variotii was purified and characterized. Aerobic growth of the microorganism was performed in submerged fermentation (SmF), with wheat bran as the carbon source . For the purification of the α-amylase, ammonium sulfate fractionation was applied, followed by ion exchange chromatography and Sephacryl S-100 gel filtration. ??% of the original enzyme was retrieved which was then characterized. The characterization included determination of various properties of the purified enzyme, such as the molecular mass, the pH and temperature that influence the enzyme’s activity and stability, the kinetic and thermodynamic parameters and the effect of metal ions on α-amylase activity. The molecular mass of the isolated α-amylase was estimated by SDS-PAGE at 75 kDa. The specific activity of α-amylase, after the final chromatographic step, was 530.2 Units/mg protein, the total yield 20.2% and the enzyme was purified 4.6-fold. The kinetic parameters Km and Vmax were determined equal to 1.41 g/L και 58.45 μmole/mg protein/min with soluble starch as the substrate. The optimum pH value is 5.0 and the optimal temperature for enzyme activity is 60 oC. Enzyme’s activation energy (Εa) was found to be 10.68 kJ.mol -1. From the calculated value of activation energy (Ea) and turnover number (kcat), the changes in enthalpy (ΔH ), entropy (ΔS ) and Gibbs free energy (ΔG ) were calculated. The enzyme retained about 80% of its activity at pH from 4.0 to 6.0 at 4 oC after 24 hours. At 30oC, 40oC and 50oC it retained 73%, 70% and 45% of its initial activity respectively after 400 min of incubation. At 60oC the enzyme is completely deactivated after 100 minutes of incubation, while at 70oC after 12 min and at 80 oC after 10 minutes of incubation. Thermal inactivation energy (E(a)d) was found to be 89.84 kJ.mol-1. The half-life of the enzyme at 70oC and 80°C was calculated at 3.3 and 2.7 min respectively, while at 50oC and 60oC it was equal to 77.9 and 40.5 min respectively. The values of D-value at 70oC and 80°C showed that in order to reduce the initial α-amylase activity by 90% required 11.0 and 8.9 min, respectively. The ΖΤ value was found to be 22.6οC. From the calculated value of thermal inactivation energy (E(a)d) and constant thermal inactivation (kd), the changes in enthalpy (ΔH ), entropy (ΔS ) and Gibbs free energy (ΔG ) were calculated. 9 The effect of metal ions Ca2+, K+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Fe3+, Fe2+, Cu2+ and Co2+ and of chelating agent EDTA on α-amylase activity was investigated. Ca2+, Mn2+ and Fe2+ were observed to increase enzyme activity, while the rest of the metal ions and EDTA had an inhibitory effect. Lastly, the products of starch, amylose, amylopectin and maltose hydrolysis by α-amylase analyzed by TLC were oligosaccharides such as maltose and maltotriose, while maltose was not hydrolyzed.	en
heal.advisorName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κροκίδα, Μαγδαληνή	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Ανάλυσης, Σχεδιασμού και Ανάπτυξης Διεργασιών και Συστημάτων (ΙΙ)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	114 σ.
heal.fullTextAvailability	true