Καθαρισμός β-γλυκοζιδάσης από τον μύκητα Paecilomyces variotti

Σισμάνη, Δανάη; Sismani, Danai

dc.contributor.author	Σισμάνη, Δανάη	el
dc.contributor.author	Sismani, Danai	en
dc.date.accessioned	2020-04-07T09:01:56Z
dc.date.available	2020-04-07T09:01:56Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/50080
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.17778
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/gr/	*
dc.subject	β-γλυκοζιδάση	el
dc.subject	Paecilomyces variotti	en
dc.subject	Καθαρισμός ενζύμου	el
dc.subject	Χρωματογραφικές μέθοδοι	el
dc.subject	Χαρακτηρισμός ενζύμου	el
dc.title	Καθαρισμός β-γλυκοζιδάσης από τον μύκητα Paecilomyces variotti	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2019-02-12
heal.abstract	Στην παρούσα διπλωματική εργασία απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε μια β-γλυκοζιδάση από τον μύκητα Paecilomyces variotti. Η αερόβια ανάπτυξη του μικροοργανισμού πραγματοποιήθηκε σε βυθισμένη ζύμωση και μελετήθηκε η επίδραση του είδους της πηγής άνθρακα (άχυρο σίτου, άχυρο κριθαριού, άξονας σπάδικα αραβόσιτου, πίτυρο σίτου, αλκαλικά προκατεργασμένο άχυρο σίτου και αλκαλικά προκατεργασμένος άξονα σπάδικα αραβόσιτου) στην παραγωγή της β-γλυκοζιδάσης. Ο άξονας σπάδικα αραβόσιτου αποδείχθηκε η βέλτιστη πηγή άνθρακα σε συγκέντρωση 4% β/ο. Η απομόνωση της β-γλυκοζιδάσης πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας αρχικά καταβύθιση των πρωτεϊνών με θειικό αμμώνιο και στη συνέχεια χρωματογραφικές τεχνικές, χρωματογραφία ιοντοεναλλαγής και χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Η διαδικασία απομόνωσης οδήγησε σε ανάκτηση του 25.3% του αρχικού ενζύμου. Ακολούθησε μελέτη των ιδιοτήτων του καθαρού ενζύμου η οποία περιελάμβανε την εύρεση του μοριακού του βάρους, των συνθηκών pH και θερμοκρασίας που επηρεάζουν τη σταθερότητα και δράση του ενζύμου, την εύρεση των κινητικών σταθερών σε υπόστρωμα κελλοβιόζη και pNPG καθώς και την αναστολή από τη γλυκόζη. Το μοριακό βάρος της β-γλυκοζιδάσης προσδιορίστηκε μρ ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και βρέθηκε ίσο με 110 kDa. Η βέλτιστη θερμοκρασία για την δράση του ενζύμου είναι 60 oC και η βέλτιστη τιμή pH είναι 4.5. Το ένζυμο διατηρεί το 80% της ενεργότητάς του κατά την επώασή του σε pH 4.5-6.0 στους 4 oC για 24 ώρες. Στους 30 oC, 40 oC και 50 oC διατηρεί το 90%, 85% και 55% της ενεργότητάς του αντίστοιχα μετά από 8 ώρες παραμονής στην κάθε θερμοκρασία. Στους 60 oC το ένζυμο απενεργοποιείται πλήρως μετά από 100 λεπτά παραμονής, ενώ στους 70 oC και τους 80 oC μετά από 10 λεπτά παραμονής. Η ενέργεια θερμικής απενεργοποίησης βρέθηκε ίση με 139.02 kJ.mol -1 . Οι χρόνοι ημίσειας ζωής του ενζύμου στους 70 και 80°C υπολογίσθηκαν ίσοι με 5.7 και 3.7 min, αντίστοιχα, ενώ στους 50 oC βρέθηκε ίσος με 8.9 ώρες. Οι τιμές των χρόνων υποδεκαπλασιασμού (D-value) στους 70 και 80°C έδειξαν ότι προκειμένου να μειωθεί η αρχική ενεργότητα της β-γλυκοζιδάσης κατά 90% απαιτούνται 18.8 και 12.3 min, αντίστοιχα. Με τη βοήθεια των 5 υπολογισθέντων τιμών της ενέργειας θερμικής απενεργοποίησης (E) και των σταθερών θερμικής απενεργοποίησης (kd ) υπολογίσθηκαν οι μεταβολές των θερμοδυναμικών μεγεθών, ενθαλπία (ΔΗ), εντροπία (ΔS) και ελεύθερη ενέργεια Gibbs (ΔG*). Τέλος, υπολογίστηκαν οι κινητικές σταθερές Km και Vmax για τα υποστρώματα pNPG και κελλοβιόζη. Οι τιμές των σταθερών είναι 0.68 mM και 4.52 mmole/mg protein/min και 3.45 mM και 0.058 mmole/mg protein/min για το pNPG και την κελλοβιόζη αντίστοιχα. Η γλυκοζιδάση παρουσιάζει μεγαλύτερη εξειδίκευση στο pNPG σε σχέση με την κελλοβιόζη, όπως προκύπτει από το λόγος καταλυτικής αποδοτικότητας kcat/Km, ο οποίος είναι πολύ μεγαλύτερος στο pNPG (12186.3 για το pNPG και 156.4 για την κελλοβιόζη). Από την εξέταση παρεμπόδισης του ενζύμου από το προϊόν βρέθηκε ότι το ένζυμο παρεμποδίζεται ισχυρά από την γλυκόζη.	el
heal.abstract	In the present thesis, a β- glucosidase from the fungus Paecilomyces variotti was isolated. Aerobic growth of the microorganism was performed in submerged fermentation (SMF). The effect of carbon source i.e. wheat straw, barley straw, corn cobs, wheat bran, alkaline pre-treated wheat straw and alkaline pre-treated corn cobs on b-glucosidase production was investgated. Corn cobs proved to be the optimal carbon source at a concentration of 4% w/ v. Purification of β-glucosidase was carried out applying ammonium sulfate fractionnation, ion exchange and hydrophobic interaction chromatography. 25.3% of the original enzyme was retrieved which was then characterized. The molecular mass of the purified PGM was estimated by SDS-PAGE at 110 kDa. The specific activity of b-glucosidase, after the final chromatographic step, was 5.6 Units/mg protein, the total yield 25.3% and the enzyme was purified 11-fold. The optimal temperature for enzyme activity is 60 oC and the optimum pH value is 4.5. The enzyme retained about 80% of its activity at pH from 4.5 to 6.0 at 4 oC after 24 hours. At 30oC, 40oC and 50oC it retained 90%, 85% and 55% of its initial activity respectively after 8 hours of incubation. At 60oC the enzyme is completely deactivated after 100 minutes of incubation, while at 70oC and 8 oC after 10 minutes of incubation. Thermal inactivation energy was found to be 139.02 kJ.mol-1. The half-life of the enzyme at 70oC and 80°C was calculated at 5.7 and 3.7 min respectively, while at 50oC it was equal to 8.9 hours. The values of D-value at 70oC and 80°C showed that in order to reduce the initial β-glucosidase activity by 90% required 18.8 and 12.3 min, respectively. From the calculated value of thermal inactivation energy (E) and constant thermal inactivation (kd), the changes in enthalpy (ΔH ), entropy (ΔS ) and Gibbs free energy (ΔG *) were calculated. Finally, the kinetic parameters Km and Vmax were were found equal with 0.68 mM και 4.52 mmole/mg protein/min for pNPG and 3.45 mM και 0.058 mmole/mg protein/min for cellobiose. The enzyme was strongly inhibited by glucose.	en
heal.advisorName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Μαγουλάς, Κωνσταντίνος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	99 σ.	el
heal.fullTextAvailability	true