Παραγωγή, απομόνωση και χαρακτηρισμός της θερμοσταθερής β-ξυλοζιδάσης sp24 από μετασχηματισμένο βακτηριακό στέλεχος E.coli BL21

Χίνη, Ιωάννα; Chini, Ioanna

dc.contributor.author	Χίνη, Ιωάννα	el
dc.contributor.author	Chini, Ioanna	en
dc.date.accessioned	2020-10-07T19:18:52Z
dc.date.available	2020-10-07T19:18:52Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/51312
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.19010
dc.rights	Default License
dc.subject	β-ξυλοζιδάση	el
dc.subject	Χαρακτηρισμός ενζύμου	el
dc.subject	Καθαρισμός ενζύμου	el
dc.subject	Θερμοσταθερό ένζυμο	el
dc.subject	Θερμόφιλο ένζυμο	el
dc.title	Παραγωγή, απομόνωση και χαρακτηρισμός της θερμοσταθερής β-ξυλοζιδάσης sp24 από μετασχηματισμένο βακτηριακό στέλεχος E.coli BL21	el
heal.type	bachelorThesis
heal.generalDescription	Στην παρούσα εργασία γίνεται η παραγωγή της β-ξυλοζιδάσης σε βακτηριακό στέλεχος E. coli και στην συνέχεια απομονώνεται και καθαρίζεται. Τέλος πραγματοποιείται ο χαρακτηρισμός του ενζύμου.	el
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2020-02-24
heal.abstract	Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η βελτιστοποίηση της ετερόλογης έκφρασης μίας θερμοσταθερής β-ξυλοζιδάσης από το βακτήριο Geobacillus sp.24. Το γονίδιο του ενζύμου κλωνοποιήθηκε σε πλασμιδιακό φορέα pET15b. Με θερμοεπαγώμενο μετασχηματισμό, έγινε εισαγωγή του πλασμιδίου φορέα, στα δεκτικά βακτήρια E. coli BL21 (DE03). Έτσι τα βακτηρίακα κύτταρα εκφράζουν το ενζυμο της β-ξυλοζιδάσης και χρησιμοποιούνται ως εμβόλιο στις καλλιέργειες που μελετήθηκαν. Διερευνήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης του IPTG (5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μΜ) στην παραγωγή του ενζύμου β-ξυλοζιδάσης και βρέθηκε ότι η βέλτιστη συγκέντρωση είναι τα 20μΜ στους 37οC σε 180 στροφές rpm και θρεπτικό μέσο LB, καθώς στις 12 ώρες ανάπτυξης η ενεργότητα του ενζύμου ανιχνεύθηκε στα 0,29 Units/mg DCW. Αντίθετα, σε θρεπτικό μέσο minimal glucose με πηγή άνθρακα γλυκόζη, εξετάστηκαν οι βέλτιστες συγκεντρώσεις IPTG (20 και 40μΜ), και η μέγιστη ενεργότητα ανήλθε σε 0,20 Units/mg DCW στη συγκέντρωση 40 μΜ IPTG στις 15 ώρες. Εν συνεχεία μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας επαγωγής (20οC, 27οC, 30ο C και 37οC) στην παραγωγή του ενζύμου β-ξυλοζιδάση για συγκέντρωση IPTG 20μΜ. Η βέλτιστη ήταν στους 37οC με ενεργότητα του ενζύμου στα 0,29 Units/mg DCW στις 12 ώρες ανάπτυξης. Ακολούθως μελετήθηκε το φαινόμενο της αυτεπαγωγής όπου η ίδια πηγή άνθρακα λειτουργεί και ως μέσο ανάπτυξης του κυττάρου και ως επαγωγέας της β-ξυλοζιδάσης. Οι πηγές άνθρακα που επιλέχθηκαν ήταν: (α) γλυκόζη, (β) λακτόζη και (γ) γαλακτόζη. Ως βέλτιστο σύστημα αυτεπαγωγής λειτούργησε αυτό που είχε ως πηγή άνθρακα την λακτόζη με μέγιστη ενεργότητα 0,18 Units/mg DCW στις 23 ώρες, αντίθετα το αυτεπαγώμενο σύστημα με πηγή άνθρακα την γαλακτόζη εμφάνισε μικρή αύξηση της κυτταρικής ανάπτυξης και μηδενική επαγωγή της πρωτεΐνης. Μελετήθηκαν επίσης καλλιέργειες με θρεπτικό μέσο γλυκόζης και επαγωγέα λακτόζης και γαλακτόζης διαφορετικών συγκεντρώσεων 1, 2, 5, 10, 15 g/L. Βρέθηκε βέλτιστη συγκέντρωση τα 10 g/L λακτόζης και γαλακτόζης αντίστοιχα, στα οποία εκτιμήθηκε η ενζυμική ενεργότητα στα 0,17 Units/mg DCW στις 33 ώρες στην περίπτωση της λακτόζης και 0,15 Units/mg DCW στις 34 ώρες στην περίπτωση της γαλακτόζης. Για την απομόνωση της β-ξυλοζιδάσης, παράχθηκε σε μεγαλύτερη κλίμακα κυτταρική καλλιέργεια ανασυνδυασμένων κυττάρων E.coli με την β-ξυλοζιδάση. Ακολούθησε ο καθαρισμός της πρωτεΐνης και ο χαρακτηρισμός. Η απομόνωση πραγματοποιήθηκε με σπάσιμο κυττάρων με υπερήχους, ο καθαρισμός με χρωματογραφία στήλης Talon, διάταξη Amicon και εξισορρόπηση στο επιθυμητό pH (dialysis), ενώ ο χαρακτηρισμός περιελάμβανε pH,T (οC) δράσης και σταθερότητας (υπολογισμός kd, t1/2 και D), επίδραση οργανικών διαλυτών, μεταλλοιόντων, SDS και EDTA στην ενεργότητα του ενζύμου, η παρεμπόδιση από την ξυλοζη, η δραστικότητα σε διάφορα υποστρώματα, κινητική και θερμοδυναμική μελέτη (Km, Vmax, kcat, Ea, ΔΗ, ΔG, ΔS, ΔGE-S και ΔG*E-T) και η δράση της β-ξυλοζιδάσης σε ξυλοολιγοσακχαρίτες με χρωματογραφία χάρτου (TLC). Τέλος, βρέθηκε η πιθανή δομή της πρωτεΐνης από την αμινοξική αλληλουχία της με το πρόγραμμα Swiss modeling tool ExPASY, συγκρίθηκε με άλλες παρόμοιες β-ξυλοζιδάσες ως προς την αμινοξική αλληλουχία της και κατασκευάστηκε φυλογενετικό δέντρο με βάση β-ξυλοζιδάσες που έχουν απομονωθεί από άλλα βακτήρια.	el
heal.advisorName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Βασιλείου, Παναγιώτα	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	102 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false