Παρασκευή μετασχηματισμένων βακτηριακών ακυτταρικών εκχυλισμάτων ως μέσο για τη σύνθεση νουκλεοτιδίων και νουκλεϊκών οξέων

Μπαρτζώκα, Ναταλία; Bartzoka, Natalia

dc.contributor.author	Μπαρτζώκα, Ναταλία	el
dc.contributor.author	Bartzoka, Natalia	en
dc.date.accessioned	2020-10-26T15:09:13Z
dc.date.available	2020-10-26T15:09:13Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/51634
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.19332
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Ακυτταρικό εκχύλισμα	el
dc.subject	Cell- free extract	en
dc.subject	Σύνθεση dNTPs	el
dc.subject	Ανακύκλωση ATP	el
dc.subject	LAMP	en
dc.subject	Διάγνωση	el
dc.subject	dNTPs synthesis	en
dc.subject	ATP recycling	en
dc.subject	LAMP	en
dc.subject	Diagnostics	en
dc.title	Παρασκευή μετασχηματισμένων βακτηριακών ακυτταρικών εκχυλισμάτων ως μέσο για τη σύνθεση νουκλεοτιδίων και νουκλεϊκών οξέων	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Χημική μηχανική	el
heal.classification	Συνθετική βιολογία	el
heal.language	el
heal.access	campus
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2020-07-16
heal.abstract	Τα μετασχηματισμένα με ανασυνδυασμό ακυτταρικά εκχυλίσματα αποτελούν ένα υποσχόμενο μέσο βιοκατάλυσης, χαμηλού κόστους, για μετασχηματισμούς πολλαπλών σταδίων με ενδογενή ανακύκλωση ακριβών συμπαραγόντων (π.χ. ATP). Σκοπό της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας αποτέλεσε η αξιολόγηση της χρησιμότητας της συγκεκριμένης προσέγγισης, σε αντιδράσεις σύνθεσης νουκλεοτιδίων και νουκλεϊκών οξέων και ειδικότερα, στην ισόθερμη αντίδραση ενίσχυσης του DNA ̇ μία τεχνολογία με εξαιρετικές προοπτικές για εφαρμογή στον τομέα του Παρακλίνιου Διαγνωστικού Ελέγχου. Αρχικά, αναπτύχθηκε μεθοδολογία για την ανασυνδυασμένη υπερέκφραση DNA πολυμεράσης από τον Geobacillus stearothermophilus (Bst), η οποία διαθέτει ικανότητα «εκτόπισης κλώνου» (strand displacement), και είναι απαραίτητη για την ισόθερμη ενίσχυση του DNA. Η ενεργότητα του καθαρού ενζύμου, το οποίο απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου (κοβαλτίου), επιβεβαιώθηκε μέσω δοκιμών LAMP (55- 65 °C), στις οποίες χρησιμοποιήθηκε ως DNA- στόχος μία χαρακτηριστική ακολουθία του Mycobacterium tuberculosis. Επιπλέον, αξιοποιώντας το συγκεκριμένο σύστημα, αποδείχτηκε ότι τα απαραίτητα -όμως ακριβά και ασταθή- εμπορικά τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (dNTPs) μπορούν να αντικατασταθούν στις αντιδράσεις LAMP από ένα ακάθαρτο αντιδρόν μίγμα στο οποίο ένα E.coli ακυτταρικό εκύλισμα (S30) καταλύει τον μετασχηματισμό των σταθερών και χαμηλού κόστους μονοφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dNMPs), μέσω ενδογενούς ανακύκλωσης της ATP, στους 37 °C. Επιπρόσθετα, διαπιστώθηκε ότι τα dNTPs μπορούν να παραχθούν σε “one pot” αντίδραση με την LAMP, μέσω προσθήκης ενός αρχικού σταδίου επώασης στους 37 °C, περιορίζοντας έτσι τους χειρισμούς ανάμεσα στις δύο αντιδράσεις. Ακόμη, παρασκευάστηκε ένα ακυτταρικό εκχύλισμα E.coli, εμπλουτισμένο με τη Bst πολυμεράση. Το συγκεκριμένο εκχύλισμα ήταν ικανό να αντικαταστήσει την καθαρή Bst σε τυπικές LAMP αντιδράσεις, καθώς και να οδηγήσει τη σύνθεση των dNTPs. Παρότι στους 55- 60 °C τα ενδογενή ένζυμα του εκχυλίσματος είναι ενεργά για τη σύνθεση των dNTPs, η ενίσχυση του DNA αποδείχτηκε μη ειδική. Το πρόβλημα αυτό αντιμετωπίστηκε επιτυχώς με χρήση διαφορετικού στελέχους (JM109(DE3)), το οποίο είναι απαλλαγμένο από παράπλευρες δράσεις νουκλεασών και ρεκομβινασών, οι οποίες θεωρήθηκαν υπεύθυνες για την παραπάνω παρατήρηση. Παράλληλα, αξιολογήθηκε η προσθήκη της πολυφωσφορικής κινάσης 2 (PPK2) από τον Meiothermus ruber σε ακυτταρικό εκχύλισμα, για την πιο αποτελεσματική σύνθεση των νουκλεοτιδίων. Πραγματοποιήθηκε ανασυνδυασμένη έκφραση της PPK2 και διαπιστώθηκε ότι είναι ικανή να καταλύσει την μετατροπή AMP προς ATP, στους 65 °C, τόσο στην καθαρή της μορφή όσο και σε ακυτταρικό εκχύλισμα. Επίσης, αποδείχτηκε ότι τα ιόντα Mg2+, τα οποία χρησιμοποιούνται στη σύνθεση των dNTPs, ήταν σε θέση να αντικαταστήσουν τον συνήθη PPK2 συμπαράγοντα (ιόντα Mn2+). Τέλος, το ακυτταρικό εκχύλισμα της PPK2 χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς για την ανακύκλωση της ATP στην αντίδραση σύνθεσης dATP από dAMP. Συμπερασματικά, η χρήση ακυτταρικών εκχυλισμάτων σε αντιδράσεις σύνθεσης νουκλεοτιδίων και ενίσχυσης του DNA, προβάλλει σημαντικά πλεονεκτήματα, μειώνοντας το κόστος και την πολυπλοκότητα και εξαλείφοντας την αναγκαιότητα ασταθών βιοχημικών αντιδραστηρίων (dNTPs), που είναι απαραίτητα σε τυπικές αντιδράσεις ενίσχυσης του DNA. Η παρούσα Διπλωματική Εργασία, προβάλλει την χρησιμότητα της συγκεκριμένης τεχνικής, ενώ ανοίγει τον δρόμο για την εφαρμογή της σε πραγματικές συνθήκες, και ειδικά στον αναπτυσσόμενο κόσμο και σε περιβάλλοντα χαμηλών πόρων.	el
heal.sponsor	Bill & Melinda Gates Foundation	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διομήδη	el
heal.committeeMemberName	Βουτσάς, Επαμεινώνδας	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.fullTextAvailability	false