Μικροδιάταξη πολλαπλασιασμού DNA κλειστού βρόχου

Σκαλτσούνης, Παναγιώτης; Skaltsounis, Panagiotis

dc.contributor.author	Σκαλτσούνης, Παναγιώτης	el
dc.contributor.author	Skaltsounis, Panagiotis	en
dc.date.accessioned	2021-01-14T15:43:07Z
dc.date.available	2021-01-14T15:43:07Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/52778
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.20476
dc.description	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο--Μεταπτυχιακή Εργασία. Διεπιστημονικό-Διατμηματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών (Δ.Π.Μ.Σ.) “Μικροσυστήματα και Νανοδιατάξεις”	el
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Μικροδιάταξη	el
dc.subject	Μικροεργαστήριο σε ψηφίδα	el
dc.subject	Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)	el
dc.subject	Μικρορευστονική	el
dc.subject	Ψηφίδα PCB	el
dc.subject	Microdevice	en
dc.subject	Lab on Chip (LOC)	en
dc.subject	Polymerase Chain Reaction (PCR)	en
dc.subject	Microfluidics	en
dc.subject	PCB Chip	en
dc.title	Μικροδιάταξη πολλαπλασιασμού DNA κλειστού βρόχου	el
heal.type	masterThesis
heal.classification	Μικρορευστονική	el
heal.classification	Microfluidics	en
heal.classification	Μικροεργαστήριο σε Ψηφίδα	el
heal.classification	Lab on Chip	en
heal.classification	Βιοϊατρική Τεχνολογία	el
heal.classification	Biomedical Technology	en
heal.classification	Πολλαπλασιασμός DNA	el
heal.classification	DNA amplification	en
heal.classification	Διαγνωστικά συστήματα στον χώρο του ασθενή	el
heal.classification	Point of care systems (POC)	en
heal.classification	Τεχνολογία PCB	el
heal.classification	PCB Technology	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2020-11-16
heal.abstract	Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (polymerase chain reaction – PCR), είναι η πιο συχνά χρησιμοποιημένη μέθοδος για τον πολλαπλασιασμό του δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA), και αποτελεί απαραίτητη διαδικασία για την ανάλυση του DNA. Οι μικρορευστονικές ψηφίδες είναι καθιερωμένα εργαλεία που σκοπεύουν στην απλοποίηση και στη διευκόλυνση της ανάλυσης του DNA, με πολλές κλινικές και επιστημονικές εφαρμογές. Σκοπός αυτής της εργασίας είναι η δημιουργία μίας απλής, γρήγορης, ευέλικτης και αποτελεσματικής μικροδιάταξης PCR. Έως τώρα, έχει αναφερθεί μία μεγάλη ποικιλία τέτοιων μικροδιατάξεων, διαφορετικών υλικών και σχεδίων. Δύο βασικές κατηγορίες των μικροδιατάξεων PCR περιλαμβάνουν τις μικροδιατάξεις στατικού δείγματος (χρονικά μεταβαλλόμενες PCR) και τις μικροδιατάξεις κινούμενου δείγματος (χωρικά μεταβαλλόμενες PCR). Οι πρώτες, τείνουν σε γενικές γραμμές, να είναι πιο χρονοβόρες και να καταναλώνουν μεγαλύτερα ποσά ενέργειας. Από την άλλη πλευρά, οι μικροδιατάξεις PCR κινούμενου δείγματος, προκειμένου να επιτύχουν την επιθυμητή ροή του δείγματος, βασίζονται συνήθως στη χρήση αντλιών, οι οποίες τείνουν να είναι ογκώδεις, στερούν την αυτονομία του συστήματος, ενώ παράλληλα αυξάνουν το κόστος και την πολυπλοκότητά του. Ταυτόχρονα, λόγω του μεγάλου μήκους καναλιού, αναπτύσσουν μεγάλη διαφορά πίεσης που απαιτεί ισχυρή σφράγιση του μικροκαναλιού. Περαιτέρω περιορισμοί μίας τυπικής χωρικά μεταβαλλόμενης PCR μικροδιάταξης, περιλαμβάνουν τον σταθερό αριθμό κύκλων, οι οποίοι συνήθως καθορίζονται από το σχεδιασμό του μικροκαναλιού, όπως και το σχετικά μεγάλο αποτύπωμα της ψηφίδας. Η παρούσα εργασία περιγράφει μία καινοτόμα μικροδιάταξη PCR, κινούμενου δείγματος, συνεχούς ροής και κλειστού βρόχου. Η μικροδιάταξη χρησιμοποιεί κυκλικό μικροκανάλι μικρού αποτυπώματος, κατασκευασμένο σε υπόστρωμα πλακέτας τυπωμένων κυκλωμάτων [printed circuit board (PCB)]. Στη μικροδιάταξη αυτή, το διάλυμα της PCR ρέει στο εσωτερικό του κυκλικού μικροκαναλιού, χωρητικότητας 9,42 μl, με τη ροή να δημιουργείται από ένα σιδηρομαγνητικό ρευστό-έμβολο. Το σιδηρομαγνητικό ρευστό έμβολο ακολουθεί την κίνηση ενός εξωτερικού μαγνήτη, ο οποίος κινείται με τη βοήθεια ενός κινητήρα, περνώντας διαδοχικά (όσες φορές χρειαστεί) από τις τρεις θερμοκρασιακές ζώνες. Το σχέδιο της ψηφίδας περιλαμβάνει δύο ενσωματωμένα μαιανδρικά θερμικά μικροστοιχεία χαλκού στο εσωτερικό του PCB υποστρώματος, ένα πολύ λεπτό στρώμα χαλκού πάνω από τα θερμικά στοιχεία που προσφέρει θερμική ομοιομορφία και ένα κυκλικό μικροκανάλι σχεδιασμένο για κατασκευή με χρήση φωτοευαίσθητου πολυϊμιδίου σε πολύ κοντινή απόσταση από τα θερμικά στοιχεία, εξασφαλίζοντας έτσι καλή μεταφορά θερμότητας. Η όλη διαδικασία κατασκευής της ψηφίδας, είναι συμβατή με την καθιερωμένη βιομηχανία PCB, επιτρέποντας έτσι τη χαμηλού κόστους, αξιόπιστη και αναπαραγώγιμη κατασκευή της και ενισχύοντας τις προοπτικές εμπορευματοποίησης μιας τέτοιας μικροδιάταξης. Ο σχεδιασμός της μικροδιάταξης βασίστηκε σε υπολογιστική μελέτη, στην οποία αναλύθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν παράμετροι όπως το σχέδιο της ψηφίδας, η ταχύτητα ροής του ρευστού, η κατανομή της θερμότητας κατά τη διάρκεια των κύκλων της PCR και το σχήμα του μαγνήτη. Η μικροδιάταξη αυτή παρέχει γρήγορες θερμοκρασιακές μεταβολές (το βασικό πλεονέκτημα των μικροδιατάξεων συνεχούς ροής), οδηγώντας σε γρήγορους κύκλους PCR, της τάξης των μερικών δευτερολέπτων. Η υπολογιστική μελέτη προτείνει πως το επιθυμητό θερμοκρασιακό πρωτόκολλο της PCR μπορεί να επιτευχθεί σε 6 s ανά κύκλο. Η ταχύτητα αυτή του κύκλου της PCR είναι υπερπενταπλάσια σε σύγκριση με παρόμοια διάταξη, κατασκευασμένη σε ψηφίδα από πολυμεθακρυλικό μεθύλιο (PMMA), σε θερμική επαφή με ογκώδη θερμαινόμενη πλάκα. Επιπλέον, το κυκλικό μικροκανάλι εξασφαλίζει μικρότερο αποτύπωμα σε σύγκριση με τις περισσότερες μικροδιατάξεις συνεχούς ροής, με τη συνολική διάμετρο της ψηφίδας να είναι 40 mm, καθώς και ευελιξία στο συνολικό αριθμό των κύκλων της PCR. Επιπρόσθετα, η επίτευξη της ροής του ρευστού με τη βοήθεια του μαγνήτη, καθιστά αχρείαστες τις εξωτερικές αντλίες. Η μικροδιάταξη που παρουσιάζεται στην παρούσα εργασία, είναι η πρώτη, από όσο γνωρίζουμε, που χρησιμοποιεί συνεχή κυκλική ροή σε PCB ψηφίδα με ενσωματωμένα θερμικά μικροστοιχεία. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τις μετρήσεις της θερμοκρασίας στην PCB ψηφίδα που κατασκευάσθηκε, σε συνδυασμό με τη μελέτη που πραγματοποιήθηκε για το μαγνητικό πεδίο και τη ροή του ρευστού, φαίνεται ότι μπορούν να οδηγήσουν στη δημιουργία μιας απλής, χαμηλού κόστους, ευέλικτης και γρήγορης μικροδιάταξης για ανάλυση DNA, βασισμένη στη μέθοδο PCR.	el
heal.abstract	Polymerase chain reaction (PCR) is the most common method used for nucleic acid (DNA) amplification and an indispensable process in DNA analysis. Microfluidic chips are well established tools aiming to simplify and facilitate PCR-based DNA analysis in various important clinical and basic science applications such as medical diagnostics. The purpose of this work is to create a simple, fast and efficient PCR microdevice. A wide variety of such chips with different materials and designs have been reported. Two basic types of PCR microdevices include stationary sample PCR microdevices (time domain PCR) and moving sample PCR microdevices (space domain PCR). Time domain PCR microdevices overall tend to be more time and energy consuming. On the other hand, space domain PCR microdevices, in order to achieve the desired flow of the DNA sample, are generally based on the use of pumps, which tend to be bulky, deprive the system of its autonomy and may also raise the system’s cost and complexity. At the same time, due to the long channel length, they develop a large pressure difference that requires strong sealing of the microchannel. Further limitations of typical space domain microdevices include the fixed number of cycles, often dictated by the channel layout, as well as the relatively large chip footprint. The present work describes a novel space domain PCR microdevice, of a continuous flow (CF) in a closed loop. The microdevice uses a circular channel, with small footprint, fabricated on printed circuit board (PCB). In this microdevice, the PCR solution flows within a circular channel of 9,42 μl capacity, the flow being created by a ferrofluid plug. The plug is driven by an external magnet which is moving with the aid of a micromotor, passing consecutively (as many times as necessary) through three temperature zones. The design of the chip comprises two integrated meandering copper microheaters within the PCB substrate, a very thin copper layer above the heaters that improves thermal uniformity, and a circular microchannel designed for fabrication using photosensitive polyimide at a very close distance to the microheater, thus ensuring good heat transfer. The whole fabrication process of the chip is compatible with the established PCB industry, thus allowing for low-cost, reliable and reproducible fabrication, enhancing the commercialization prospects of such a device. The design of the microdevice is based on a computational study, analyzing and optimizing various parameters, such as the design of the chip, the flow velocity, the thermal distribution during the PCR cycles and the magnet’s shape. This microdevice provides quick temperature transitions (the main advantage of CF microdevices), leading to fast PCR cycles, on the order of a few seconds. The computational study suggests that the desired PCR temperature protocol can be obtained at 6 s per cycle, which is more than five times faster than in a similar device fabricated on a polymethyl methacrylate (PMMA) chip, in contact with bulky Peltier elements. Moreover, the circular channel ensures a smaller footprint compared with most CF microdevices, the total diameter of the chip being 40 mm, as well as flexibility for the total number of PCR cycles. Furthermore, the magnet driven flow spares the device from the use of pumps. The herewith presented microdevice is the first, to our knowledge, to use circular continuous flow on a PCB chip with embedded microheaters. The results that emerged from the temperature measurements on the PCB chip, in combination with the analysis made on the magnetic field and fluid flow, appears to result in a simple, cost saving, flexible and fast method for PCR-based DNA amplification.	en
heal.advisorName	Κόκκορης, Γεώργιος	el
heal.committeeMemberName	Κόκκορης, Γεώργιος	el
heal.committeeMemberName	Τσερέπη, Αγγελική	el
heal.committeeMemberName	Τσουκαλάς, Δημήτριος	el
heal.academicPublisher	Σχολή Εφαρμοσμένων Μαθηματικών και Φυσικών Επιστημών	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	135 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false