Χαρακτηρισμός ενζύμων για τη βελτιστοποίηση της υδρόλυσης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας και αξιοποίηση αυτής για την παραγωγή μεταβολιτών υψηλής προστιθέμενης αξίας με χρήση μικροφυκών.

Μπαριτάκη, Καλλιόπη; Baritaki, Kalliopi

dc.contributor.author	Μπαριτάκη, Καλλιόπη	el
dc.contributor.author	Baritaki, Kalliopi	en
dc.date.accessioned	2021-03-18T07:15:15Z
dc.date.available	2021-03-18T07:15:15Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/53082
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.20780
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Λυτικές πολυσακχαριτικές μονοοξυγενάσες	el
dc.subject	Εικοσιδιεξανοϊκό οξύ	el
dc.subject	Lytic polysaccharide monooxygenases	en
dc.subject	Myceliopthora thermophila	en
dc.subject	Pichia pastoris	en
dc.subject	Docosahexaenoic acid	en
dc.subject	Crypthecodinium cohnii	en
dc.title	Χαρακτηρισμός ενζύμων για τη βελτιστοποίηση της υδρόλυσης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας και αξιοποίηση αυτής για την παραγωγή μεταβολιτών υψηλής προστιθέμενης αξίας με χρήση μικροφυκών.	el
dc.title	Enzyme characterization to optimize the hydrolysis of lignocellulosic biomass and its utilization for the production of high added value metabolites using microalgea.	en
dc.contributor.department	Τομέας IV: Σύνθεση και ανάπτυξη βιομηχανικών διαδικασιών - Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.type	bachelorThesis
heal.generalDescription	Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι ο χαρακτηρισμός μιας λυτικής πολυσακχαριτικής μονοοξυγενάσης, η οποία συμβάλλει στη βελτιστοποίηση της ενζυμικής υδρόλυσης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Παράλληλα, εξετάστηκε η προοπτική αξιοποίησης της βιομάζας για την ενίσχυση της παραγωγής εικοσιδιεξανοϊκού οξέος (DHA) από το μικροφύκος, Crypthecodinium cohnii.	el
heal.generalDescription	The main purpose of this diploma thesis is the characterization of lytic polysaccharide monooxygenase which contributes to the optimization of the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass. At the same time, the perspective of biomass utilization was examined in order to enhance the production of docosahexaenoic acid (DHA) from the microalgae, Crypthecodinium cohnii.	en
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2021-02-26
heal.abstract	Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι ο χαρακτηρισμός μιας λυτικής πολυσακχαριτικής μονοοξυγενάσης, η οποία συμβάλλει στη βελτιστοποίηση της ενζυμικής υδρόλυσης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Παράλληλα, εξετάστηκε η προοπτική αξιοποίησης της βιομάζας για την ενίσχυση της παραγωγής εικοσιδιεξανοϊκού οξέος (DHA) από το μικροφύκος, Crypthecodinium cohnii. Η πολύπλοκη δομή της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας καθιστά αναγκαία την εξέλιξη των τεχνικών προ επεξεργασίας, ώστε να μεγιστοποιηθεί η απόδοση απλών σακχάρων, χρήσιμων στην παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Οι πρωτεΐνες LPMO δρουν οξειδωτικά, λύοντας γλυκοζιτικούς δεσμούς της πολυσακχαριτικής αλυσίδας. Σημαντικό χαρακτηριστικό αποτελεί η δράση τους σε ανθεκτικά υποστρώματα. Στη συγκεκριμένη μελέτη, το γονίδιο που κωδικοποιεί το ένζυμο, προέρχεται από το μύκητα Myceliophthora thermophila και εκφράζεται στη μεθυλότροφη ζύμη, Pichia pastoris. Αφετηρία του πειραματικού μέρους αποτέλεσε η παραγωγή και απομόνωση 16.35 mg ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης από υγρές καλλιέργειες της P. pastoris. Έπειτα, η αλληλουχία της LPMO και πληροφορικά εργαλεία συνέβαλαν στον προσδιορισμό των Ο-γλυκοζυλιώσεων που φέρει. Το μοριακό βάρος, που κυμαίνεται στα 29-42 kDa, υπο-λογίστηκε με ηλεκτροφόρηση της πρωτεΐνης. Παράλληλα, τα υποστρώματα δράσης της LPMO ορίστηκαν με τον εντοπισμό προϊόντων, μέσω της χρωματογραφίας εναλλαγής ανιόντων υψηλής απόδοσης. Ως δότης ηλεκτρονίων χρησιμοποιήθηκε το ασκορβικό οξύ. Η πρωτεΐνη, λοιπόν, φάνηκε να διασπά την χιτίνη και το άμυλο, ενώ σε μικρότερο βαθμό την κυτταρίνη, επεξεργασμένη με φωσφορικό οξύ (Pasc) ή μικροκρυσταλλική (Avicel). Ταυτόχρονα, δραστικότητα σημειώθηκε στους ολιγοσακχαρίτες, κελλοπενταόζη και κελλοεξαόζη, σε αντίθεση με τους πολυσακχαρίτες ξυλάνη, αραβινοξυλάνη και γλυ-κομαννάνη. Στην συνέχεια, εστιάζοντας στην ύπαρξη συνεργιτισμού με τις κυτταρινάσες, προέκυψε αύξηση της συγκέντρωσης των αναγωγικών σακχάρων για τη συνδυαστική δράση της LPMO με την ενδογλουκανάση (EG5). Μελετώντας τους πιθανούς δότες ηλε-κτρονίων, ξεχώρισε το ασκορβικό κι ακολούθησε το γαλλικό και το καφεϊκό οξύ. Τέλος, κατά τον προσδιορισμό της βέλτιστης τιμής pH και θερμοκρασίας, αναδείχθηκε το pH=6 και οι 50οC, αντίστοιχα. Εκτός των παραπάνω, επιχειρήθηκε η παραγωγή του εικοσιδιεξανοϊκού οξέος (DHA) από το στέλεχος του μικροφύκους, Crypthecodinium cohnii ATCC 30772. Η επι-λογή του C. cohnii οφείλεται στη μεγάλη ποσότητα DHA που μπορεί να αποδώσει, απο-κλείοντας τη σύνθεση άλλων πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Δημιουργήθηκαν, λοιπόν, υγρές καλλιέργειες του μικροφύκους, επιλέγοντας ως πηγή άνθρακα γλυκόζη, προερχόμενη από την ενζυμική υδρόλυση Avicel και βιομαζών πεύκου. Τα λιπαρά οξέα που προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο της αέριας χρωματογραφίας GC-FID, ήταν το C14:0, C16:0, C18:0, C18:1 και C22:6 (DHA). Οι βιομάζες πεύκου απέδωσαν το μεγαλύτερο ποσοστό λιπαρών οξέων, 46-50% επί της ξηρής βιομάζας ενώ το Avicel έφτασε στο 25.32%. Ωστόσο, η υψηλότερη συγκέντρωση DHA σημειώθηκε για το Avicel σε ποσοστό 36.56% του συνόλου των λιπαρών οξέων, ενώ για τις βιομάζες κυμάνθηκε στο 4-20%. Τέλος, μελετήθηκε και η κυτταρική ανάπτυξη του μικροφύκους σε γλυκόζη που παραλήφθηκε από 6 βιομάζες οξιάς. Τα δείγματα διέφεραν στην προεπεξεργασία που είχαν υποστεί ως προς τον οργανικό διαλύτη (αιθανόλη, ακετόνη και τετραϋδροφουράνιο), την πίεση (8-16 bar), τη θερμοκρασία (150-160οC) και τον χρόνο αντίδρασης (60-120 min).	el
heal.abstract	The main purpose of this diploma thesis is the characterization of lytic polysaccharide monooxygenase which contributes to the optimization of the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass. At the same time, the perspective of biomass utilization was examined in order to enhance the production of docosahexaenoic acid (DHA) from the microalgae, Crypthecodinium cohnii. The complex structure of lignocellulosic biomass makes the development of pre-treatment techniques necessary so as to maximize its conversion to simple sugars, which are useful in the manufacture of high added value products. LPMO proteins act oxidatively, cleaving glycosidic bonds of the polysaccharide chain. An important characteristic is their action on recalcitrant substrates. In this thesis, the enzyme is coded by a gene that comes from the fungus Myceliophthora thermophila and it is expressed in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. The experimental procedure began with the production and separation of 16.35 mg of recombinant protein from submerged cultures of P. pastoris. Afterwards, LPMO sequence and online tools contributed to the O-linked glycosylation determination. The molecular weight that ranges between 29-42 kDa, was estimated through protein elec-trophoresis. Meanwhile, the substrates on which LPMO is active were defined by the products detection, through high performance anion exchange chromatography. Ascorbic acid was used as an electron donor. Thus, it was found that protein cleaves chitin and starch, whereas it has a limited activity on cellulose, phosphoric acid swollen (Pasc) and microcrystalline (Avicel). At the same time, LPMO was active on oligosaccharides, cellopentaose and cellohexaose, in contrast to polysaccharides xylan, arabinoxylan and glucomannan. Later, by focusing on synergism existence with the cellulases, a concen-tration increase of the reducing sugars occurred as for the combinatorial effect of LPMO with the endoglucanase (EG5). Delving into the potential electron donors, ascorbic acid was distinguished and subsequently gallic and caffeic acid. At a later point, in the definition process of the optimum pH as well as temperature, the pH=6 and 50οC were distinguished, respectively. Apart from the above mentioned, the docosahexaenoic acid (DHA) production was attempted from the microalgae strain, Crypthecodinium cohnii ATCC 30772. C. cohnii’s selection is due to the great DHA quantity that it may render, excluding the formulation of other polyunsaturated fatty acids. Microalgae liquid cultures were created by selecting glucose as a carbon source, which came from the enzymatic hydrolysis of Avicel and pine biomasses. The fatty acids which were determined by the gas chromatography GC-FID method, were C14:0, C16:0, C18:0, C18:1 and C22:6 (DHA). Pine biomasses resulted in the greatest fatty acids per-centage, 46-50%, of the dry biomass whereas Avicel reached 25.32%. However, the highest DHA concentration occurred for the Avicel at a percentage of 36.56% on the fatty acids total, whereas for the biomasses, it ranged between 4-20%. At the end, the mi-croalgae cell growth with glucose, derived from the hydrolysis of 6 samples of beech wood biomass, was examined. Samples differed in the pre-treatment methods that they had undergone regarding the organic solvent (ethanol, acetone and tetrahydrofuran), pressure (8-16 bar), temperature (150-160οC) and the reaction time (60-120 min).	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Μαγουλάς, Κωνσταντίνος	el
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διομή	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	173 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false