Κλωνοποίηση και ετερόλογη έκφραση μιας κελλοβιοϋδρολάσης της οικογένειας GH7 του θερμόφιλου μύκητα Sporotrichum thermophile

Abstract

Η παρούσα διπλωματική εργασία είχε ως αντικείμενο την κλωνοποίηση και την ετερόλογη έκφραση ενός γονιδίου του θερμόφιλου κυτταρινολυτικού μύκητα Sporotrichum thermophile το οποίο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη με ενεργότητα κελλοβιοϋδρολάσης (έξω-1,4-β-D-γλουκανάσης) [EC 3.2.1.91] της οικογένειας 7 της ευρύτερης ομάδας των γλυκοσιδασών. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία του γονιδίου ανασύρθηκε από τη βάση δεδομένων Genome Portal όπου κατατίθεται το γονιδίωμα του S. thermophile. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε διαδικασία απομόνωσης του ολικού DNA του S. thermophile και ακολούθησε η in vitro ποσοτική ενίσχυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του γονιδίου από το δείγμα γονιδιωματικού DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης επικάλυψης/επέκτασης χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση των δύο κωδικοποιουσών περιοχών του γονιδίου (εξώνια) και την παραγωγή τμημάτων DNA που αποτελούνταν από την συνένωση των δύο περιοχών. Η ένθεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας στον πλασμιδιακό φορέα κλωνοποίησης pCR® Blunt πραγματοποιήθηκε μέσω αντίδρασης συνένωσης και επακολούθησε ο μετασχηματισμός επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων E. coli. Η αλληλουχία απομονώθηκε και εισήχθη στον πλασμιδιακό φορέα pPICZαC και τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια χρησιμοποιήθηκαν για το μετασχηματισμό στελεχών E. coli. Κατόπιν απομόνωσης και γραμμικοποίησης του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου, πραγματοποιήθηκε διαδικασία μετασχηματισμού ευκαρυωτικών κυττάρων του μεθυλότροφου ζυμομύκητα Pichia pastoris με ηλεκτροδιάτρηση. Η έκφραση της ετερόλογης αλληλουχίας από τα μετασχηματισμένα στελέχη Pichia pastoris μελετήθηκε σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας. Η μελέτη κατέδειξε ικανοποιητικά επίπεδα ανάπτυξης της βιομάζας, ενώ δεν ανιχνεύθηκε ενεργότητα του ενζύμου σε ειδικές δοκιμές με υποστρώματα μικροκρυσταλλικής κυτταρίνης και υποκατεστημένου πυρανοζίτη pNPC (p-nitrophenyl-β-D-cellobioside). Εντούτοις, η μελέτη συνεχίστηκε με την παραγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας με σκοπό την ανάκτηση και τον καθαρισμό της πρωτεΐνης από το υπερκείμενο υγρό των καλλιεργειών. Το μοριακό βάρος της απομονωθείσας πρωτεΐνης προσδιορίστηκε στα 57 kDa κατόπιν ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, τιμή η οποία βρίσκεται σε συμφωνία με την θεωρητικά υπολογιζόμενη τιμή, όπως αυτή εκτιμήθηκε με τη βοήθεια του υπολογιστικού αλγορίθμου ProtParam. Κατά τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό, εμφανίστηκαν περισσότερες από μια ζώνες οι οποίες υποδεικνύουν μερική πρωτεόλυση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Η καθαρή πρωτεΐνη παρουσιάζει χαμηλή ειδική ενεργότητα (0.02 U/mg) σε υπόστρωμα μικροκρυσταλλικής κυτταρίνης 2% w/v. Τέλος, έγινε μοντελοποίηση της τρισδιάστατης δομής της πρωτεΐνης με το υπολογιστικό πρόγραμμα SWISS-MODEL. Από τη μελέτη αυτή προέκυψε μια διαμόρφωση τυπική για τα ένζυμα της οικογένειας 7. Εντούτοις, η σταθεροποίηση της δομής περιλαμβάνει το σχηματισμό αρκετών δισουλφιδικών γεφυρών. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, υπάρχουν παραδείγματα μη σωστού σχηματισμού δισουλφιδικών δεσμών από το ετερόλογο σύστημα έκφρασης Pichia pastoris, γεγονός που μπορεί να συνδέεται με την έλλειψη ενζυμικής ενεργότητας ενώ συγχρόνως διαμορφώνει τη βάση για περεταίρω μελέτη.

The present thesis focuses on cloning and heterologous expression of a gene from the thermophilic cellulolytic fungus Sporotrichum thermophile encoding a glycosyl hydrolase family 7 protein exhibiting cellobiohydrolase (exo-1,4-β-D-glucanase) [EC 3.2.1.91] activity. The nucleotide sequence of the gene was recovered from the Genome Portal database, where the S. thermophile genome is deposited. At first, a procedure for isolation of total DNA from S. thermophile was performed and followed by the in vitro quantitative amplification of the gene from the genomic DNA sample using polymerase chain reaction. The overlap extension polymerase chain reaction method was used to amplify the two coding regions of the gene (exons) and produce DNA fragments consisting of the two regions spliced together. The nucleotide sequence was inserted into the plasmid cloning vector pCR® Blunt via a ligation reaction and transformation of competent bacterial cells E. coli followed. The DNA sequence was isolated and inserted into the plasmid vector pPICZαC and the recombinant plasmids were used to transform E.coli strains. After the isolation and the linearization of the recombinant plasmid, a procedure for transformation of eukaryotic cells of the methylotrophic yeast Pichia pastoris by electroporation was performed. The expression of the heterologous sequence in the modified strains was studied in small scale cultures. The study showed satisfactory levels of biomass growth, while no enzyme activity was detected when the enzyme was assayed in the presence of microcrystalline cellulose and substituted pyranoside pNPC (p-nitrophenyl-β-D-cellobioside) substrates. Nevertheless, the study continued with the production of the recombinant protein in large scale cultures in order to recover and purify the protein from the cultures supernatant. The molecular weight of the isolated protein was determined to 57 kDa after SDS-PAGE, a value which is found to be in agreement with the theoretically calculated value, as estimated from the computational algorithm ProtParam. After the electrophoretic separation, more than one bands occurred indicating partial proteolysis of the recombinant protein. The purified enzyme showed low specific activity (0.02 U/mg) towards microcrystalline cellulose 2% w/v. Finally, a model of the three-dimensional structure of the protein was build using the computer program SWISS-MODEL. From this study arose a protein conformation which is typical for the family 7 enzymes. However, the stabilization of the structure comprises several disulfide bridges. According to the literature, there are examples of improper disulfide bonds formation by the heterologous expression system Pichia pastoris, a fact that might be associated with the lack of enzymatic activity while forms the base for further study.