ΕΠΙΛΟΓΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΘΕΡΜΟΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΥΔΡΟΛΥΤΙΚΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΑΠΟ ΜΕΤΑΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΕΣ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΕΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΑΠΟ ΑΚΡΑΙΑ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΑ

Ζαραφέτα, Δήμητρα

dc.contributor.author	Ζαραφέτα, Δήμητρα	el
dc.date.accessioned	2021-05-13T09:36:28Z
dc.date.available	2021-05-13T09:36:28Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/53415
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.21113
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	ένζυμα	el
dc.subject	μεταγονιδιωματική σάρωση	el
dc.subject	βιοτεχνολογία	el
dc.subject	μεταγονιδιωματικές βιβλιοθήκες	el
dc.subject	thermostable	en
dc.subject	hydrolases	en
dc.subject	metagenomic analysis	en
dc.subject	enzymes	en
dc.subject	θερμοανθεκτικές	el
dc.subject	υδρολάσες	el
dc.title	ΕΠΙΛΟΓΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΘΕΡΜΟΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΥΔΡΟΛΥΤΙΚΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΑΠΟ ΜΕΤΑΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΕΣ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΕΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΑΠΟ ΑΚΡΑΙΑ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΑ	el
dc.contributor.department	Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.type	doctoralThesis
heal.classification	ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ	el
heal.classificationURI	http://data.seab.gr/concepts/17d26c7ad4b1baa3e1976533f499eef793ef5338
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2017-05-22
heal.abstract	Οι υδρολάσες είναι μια οικογένεια ενζύμων που καταλύουν την υδρόλυση ενός μεγάλου εύρους υποστρωμάτων και μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη βιομηχανικές βιομετατροπές προς την παραγωγή πληθώρας προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η χρήση τους δύναται να αντικαταστήσει τις καθαρά χημικές μεθόδους επεξεργασίας των υλικών καθώς απαιτεί ηπιότερες συνθήκες, και είναι αποδοτικότερη και ακριβέστερη λόγω της υψηλής εξειδίκευσης των ενζύμων, οδηγώντας έτσι σε μια πιο «πράσινη» βιομηχανία. Παρότι τα πλεονεκτήματα χρήσης των υδρολασών στη βιομηχανία είναι πολλά, η χρήση τους περιορίζεται από το γεγονός ότι οι συμβατικοί βιοκαταλύτες καθίστανται ανενεργοί στις υψηλές θερμοκρασίες και σε άλλες «αντίξοες» συνθήκες που συχνά επικρατούν στις βιομηχανικές διεργασίες. Το κόστος ψύξης και απομάκρυνσης των αποδιατακτικών παραγόντων πριν την προσθήκη των ενζύμων προς αποφυγή της αποδιάταξής τους, είναι τις περισσότερες φορές απαγορευτικό και αυτός είναι ο λόγος που περιορίζει την αντικατάσταση των κλασσικών χημικών κατεργασιών από ενζυμικές μετατροπές. Μια λύση σε αυτό το πρόβλημα, που καθιστά τις ενζυμικές διεργασίες οικονομικά βιώσιμες, αποτελεί η χρήση θερμοσταθερών και εν γένει σταθερών υδρολασών. Για το λόγο αυτό, το ενδιαφέρον των βιοτεχνολόγων έχει στραφεί τα τελευταία χρόνια στην ανακάλυψη θερμοσταθερών βιοκαταλυτών. Στη φύση, τα ένζυμα αυτά απαντώνται στην πρωτεϊνική φαρέτρα των ακραιόφιλων οργανισμών, των οργανισμών δηλαδή που έχουν προσαρμοστεί εξελικτικά σε ακραία περιβάλλοντα. Επειδή όμως το 99% της μικροβιακής βιοποικιλότητας δεν μπορεί να καλλιεργηθεί στο εργαστήριο, για χρόνια, η συντριπτική πλειοψηφία των οργανισμών αυτών και των πρωτεϊνών τους παρέμεινε ανεξερεύνητη. Τα τελευταία χρόνια,μέσω της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης που απαλείφει την ανάγκη της μικροβιολογικής καλλιέργειας, οι βιοτεχνολόγοι απέκτησαν πρόσβαση στον τεράστιο πρωτεϊνοχώρο των ακραιόφιλων οργανισμών. Σε αυτή τη διατριβή, η οποία εκπονήθηκε στο πλαίσιο της διεθνούς κοινοπραξίας “Hotzyme”, η βιοπληροφορική και η in vivo λειτουργική σάρωσης μεταγονιδιωματικών βιβλιοθηκών που προέκυψαν από δειγματοληψίες ακραίων ενδιαιτημάτων, οδήγησε στην ανακάλυψη τριών νέων θερμοσταθερών υδρολασών. Τα αντίστοιχα γονίδια που κωδικοποιούν αυτές τις υδρολάσες εντοπίστηκαν και ανακτήθηκαν από τις μεταγονιδιωματικές βιβλιοθήκες, και μετά από ετερόλογη έκφραση τους σε βακτηριακά κύτταρα E. coli, τα ανασυνδυασμένα ένζυμα απομονώθηκαν και μελετήθηκαν βιοχημικά. Συνοπτικά, το πρώτο ένζυμο που απομονώθηκε είναι η θερμοανθεκτική ενδογλουκανάση CelDZ1. Η CelDZ1 προέκυψε από τη βιοπληροφορική σάρωση δείγματος εμπλουτισμού Ισλανδικής θερμοπηγής και ανήκει στη οικογένεια GH5. Η CelDZ1 είναι μια θερμοανθεκτική, οξεόφιλη ενδογλουκανάση με βέλτιστες συνθήκες δράσης το pH 5 και τους 70 oC. Παράλληλα, η νέα ενδογλουκανάση παρουσιάζει εντυπωσιακή αλοανθεκτικότητα και αλοσταθερότητα αφού διατηρεί την ενεργότητα της σε συγκεντρώσεις αλάτων που τείνουν στον κορεσμό. Σε συνεργασία με τους εταίρους μας μελετήθηκε η κρυσταλλική της δομή η οποία αποκάλυψε ότι η CelDZ1 διαφέρει από τις ομόλογες πρωτεΐνες καθώς υπολείπεται της υποπεριοχής-2 πρόσδεσης των σακχαριτών. Το δεύτερο ένζυμο που απομονώθηκε και μελετήθηκε σε αυτή τη διατριβή είναι η εστεράση EstDZ2, η οποία προέκυψε μέσω βιοπληροφορικής σάρωσης του μεταγονιδιωματικού υλικού Ρωσικής θερμοπηγής. Η νέα εστεράση είναι θερμοσταθερή, με χρόνο ημιζωής πάνω από έξι ώρες στους 60 οC και παρουσιάζει εξαιρετική σταθερότητα σε υψηλές συγκεντρώσεις οργανικών διαλυτών. Η φυλογενετική μελέτη της νέας εστεράσης έδειξε ότι η EstDZ2 εγκαινιάζει μια νέα οικογένεια λιπολυτικών ενζύμων που φέρει το χαρακτηριστικό καταλυτικό αμινοξικό μοτίβο GHSAG, την οποία και ονομάσαμε Οικογένεια XV. Παράλληλα, η μελέτη του μοντέλου της τρισδιάστατης δομής της EstDZ2 έδειξε ότι πιθανότατα το νέο ένζυμο να υπολείπεται μεγάλο μέρος της χαρακτηριστικής δομής του «πρωτεϊνικού καπακιού» που συναντάται στις δομές των μελών της κοντινότερης οικογένειας ΙV των λιπολυτικών ενζύμων. Τέλος, το τρίτο ένζυμο που απομονώθηκε και μελετήθηκε σε αυτή τη διατριβή είναι η εστεράση EstDZ3, ένα υπερ-θερμοσταθερό ένζυμο που διατηρεί την καταλυτική του δράση ακόμα και μετά από πολύωρη επώαση σε θερμοκρασίες κοντά στο βρασμό. H νέα εστεράση εντοπίστηκε μετά από in vivo λειτουργική σάρωση του γενετικού υλικού βακτηριακού στελέχους που απομονώθηκε από δείγμα εμπλουτισμού Κινεζικής θερμοπηγής. Πέρα από την εξαιρετική θερμοσταθερότητα της, η ΕstDZ3 παρουσιάζει σταθερότητα και σε υψηλές συγκεντρώσεις οργανικών διαλυτών. Παράλληλα, η μελέτη του μοντέλου της δομής της, έδειξε ότι πρόκειται για ένα ένζυμο που φέρει ένα πρωτεϊνικό ένθετο της δομής α/β, παρόμοιο με αυτό της πλησιέστερης δομικά πρωτεΐνης, που προβλέπεται να παίζει καθοριστικό ρόλο στην εκλεκτικότητα του ενζύμου. Και τα τρία νέα ένζυμα παρουσιάζουν χαμηλή ομολογία με ήδη γνωστές και χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες κάτι που σε συνδυασμό με τα ενδιαφέροντα βιοχημικά και δομικά τους χαρακτηριστικά τα καθιστά τόσο υποψήφιους βιοκαταλύτες για βιοτεχνολογικές εφαρμογές όσο και μοριακά μοντέλα για τη μελέτη τηςθερμοσταθερότητας των πρωτεϊνών και όχι μόνο.	el
heal.sponsor	“Hotzyme”–EU/FP7/KBBE-2010.3.5-04	en
heal.sponsor	ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΑ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΑ ΑΡΙΣΤΕΙΑΣ ΙΚΥ/SIEMENS»-23404	el
heal.advisorName	Κολίσης, Φραγκίσκος	el
heal.committeeMemberName	Κολίσης, Φραγκίσκος	el
heal.committeeMemberName	Σκρέτας, Γεώργιος	el
heal.committeeMemberName	Λυμπεράτος, Γεράσιμος	el
heal.committeeMemberName	Σμόνου, Ιουλία	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Χατζηνικολάου, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.academicPublisher	Σχολή Χημικών Μηχανικών	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	146
heal.fullTextAvailability	true