BIOSYNTHESIS AND GENETIC SELECTION OF OLIGOPEPTIDES
WITH POTENTIALLY THERAPEUTIC EFFECTS AGAINST ALZHEIMER’S DISEASE:
INHIBITORS OF AMYLOID-β AGGREGATION

Μάτης, Ηλίας

dc.contributor.author	Μάτης, Ηλίας	el
dc.date.accessioned	2021-05-14T11:07:15Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/53430
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.21128
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Κυκλικά πεπτίδια	el
dc.subject	Βιοσύνθεση	el
dc.subject	Alzheimer	el
dc.subject	Cyclic peptides	en
dc.subject	Biosynthesis	en
dc.subject	Βιοχημική μηχανική	el
dc.subject	Biochemical engineering	en
dc.title	BIOSYNTHESIS AND GENETIC SELECTION OF OLIGOPEPTIDES WITH POTENTIALLY THERAPEUTIC EFFECTS AGAINST ALZHEIMER’S DISEASE: INHIBITORS OF AMYLOID-β AGGREGATION	en
dc.title	Βιοσύνθεση και γενετική επιλογή ολιγοπεπτιδίων με εν δυνάμει θεραπευτικές ιδιότητες κατά της νόσου Alzheimer: Αναστολείς της συσσωμάτωσης της Αμυλοειδικής β πρωτεΐνης.	el
dc.contributor.department	Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.type	doctoralThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.dateAvailable	2022-05-13T21:00:00Z
heal.language	en
heal.access	embargo
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2018-07-04
heal.abstract	Alzheimer’s disease (AD) is the most devastating neurodegenerative disease and the most common form of dementia. So far, AD drug candidates have been deemed unable to halt disease progression and, thus, effective therapeutics are in enormous demand. The pathogenesis of AD has been strongly linked to amyloid β (Aβ), a peptide composed of 37-43 amino acids with the tendency to form neurotoxic oligomeric and aggregated structures. As a result, the discovery of small-molecule and biological inhibitors of Aβ aggregation presents an attractive therapeutic approach for the treatment of AD, which has been pursued aggressively by the pharmaceutical industry. The work presented herein describes the development of engineered bacterial cells with the ability to function as a discovery platform for chemical rescuers of Aβ misfolding and neurotoxic aggregation, with potentially therapeutic properties against AD. In this system, combinatorial libraries of cyclic peptides with extended chemical diversities are biosynthesized in Escherichia coli cells and simultaneously screened for their ability to inhibit the aggregation of Aβ, using an ultrahigh-throughput genetic assay. This assay detects bioactive cyclic peptides that enhance the fluorescence of a chimeric Αβ fusion with the green fluorescent protein (GFP). Both the fusion and the cyclic oligopeptide libraries under investigation are co-expressed in the engineered bacteria, and selection of individual, fluorescent bacterial clones is performed via fluorescence-activated cell sorting (FACS). By using this engineered system, a library of more than 10 million different short cyclic peptides was biosynthesized and rapidly screened, and hundreds of bioactive peptides with putative modulatory effects on Aβ aggregation were identified. From the isolated hits, two cyclic pentapeptides with sequences cyclo SASPT and cyclo TAFDR, termed AβC5-34 and AβC5-116 respectively, were acquired in isolated form, following chemical synthesis, and their effects on Αβ aggregation were investigated in a variety of biochemical, biophysical and biological assays in vitro. These analyses revealed that the selected cyclic peptides interfered with the normal course of Αβ aggregation, leading to the formation of atypical Aβ aggregates that exhibited reduced neurotoxicity compared to that of typical Αβ aggregates. The protective effects of AβC5-34 and AβC5-116 against the aggregation and cytotoxicity of Aβ were also evaluated in vivo, using established transgenic Caenorhabditis elegans models of AD, expressing human Aβ. These assays revealed that AβC5 34 and AβC5 116 exerted a protective effect against the aggregation and cytotoxicity of Aβ. Thus, AβC5 34 and AβC5 116 constitute attractive lead molecules, which upon further evaluation can aid in the development of effective anti-amyloid therapies against AD. Finally, a combination of site-directed mutagenesis and next-generation sequencing analysis of the hits derived from screening, allowed the discovery of structure-activity relationships within the selected peptide population and revealed the existence of distinct families of bioactive cyclic peptides. The herein engineered bacterial platform exhibits a number of important advantages. First, it enables the easy and efficient screening of molecular libraries with enhanced chemical diversities. Second, the incorporation of a FACS-based screening assay allowed for rapid selection with enhanced hit-yields, compared to conventional plate-based screening assays. Third, it bypasses the need for any prior structural knowledge or preparation of specific aggregated states of Aβ. Finally, since the utilized genetic system is designed to monitor protein misfolding and aggregation, the present work serves as a proof-of-concept for other misfolding-prone protein targets associated with conformational diseases. Indeed, published and ongoing work at the Laboratory of Enzyme & Synthetic Biotechnology of the National Hellenic Research Foundation has demonstrated that the same approach can be successfully applied in the discovery of cyclic peptide rescuers for a variety of disease-associated proteins, such as the mutant Cu/Zn superoxide dismutase, mutant p53 and polyglutaminated huntingtin.	en
heal.abstract	Η νόσος Alzheimer αποτελεί την πλέον ολέθρια νευροεκφυλιστική νόσο και την πιο διαδεδομένη μορφή άνοιας. Μέχρις στιγμής, υποψήφιες ενώσεις για την αντιμετώπιση της νόσου δεν έχουν επιδείξει ικανότητα αναχαίτησης της προόδου της νόσου, με αποτέλεσμα την αυξημένη αναγκαιότητα εύρεσης νέων θεραπευτικών ενώσεων. Η παθογένεια της νόσου Alzheimer έχει συσχετιστεί με το αμυλοειδές-β (Αβ), ένα πεπτίδιο 37-43 αμινοξέων το οποίο εμφανίζει εγγενή τάση σχηματισμού ολιγομερών και αδιάλυτων συσσωματωμάτων με νευροτοξικές ιδιότητες. Κατά συνέπεια, η ανακάλυψη μικρομοριακών βιολογικών αναστολέων της συσσωμάτωσης του Αβ αποτελεί μία ελκυστική θεραπευτική προσέγγιση για την αντιμετώπιση της νόσου, η οποία έχει αποτελέσει βασική επιδίωξη της φαρμακευτικής βιομηχανίας. Η συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή περιγράφει το σχεδιασμό και ανάπτυξη ενός βακτηριακού συστήματος το οποίο δύναται να λειτουργήσει ως πλατφόρμα ανακάλυψης βιοδραστικών ενώσεων, με αποτρεπτική δράση ως προς τη συσσωμάτωση του Αβ, καθώς και τη συνεπαγόμενη νευροτοξικότητά του. Για αυτό το σκοπό, βιβλιοθήκες κυκλικών πεπτιδίων παράγονται βιοσυνθετικά σε κύτταρα E. coli ενώ παράλληλα υποβάλλονται σε διαλογή με κριτήριο την ικανότητά τους να παρεμποδίζουν τη συσσωμάτωση του Αβ, χρησιμοποιώντας μια γενετική δοκιμασία υψηλού ρυθμού απόδοσης. Η εν λόγω γενετική δοκιμασία παρέχει τη δυνατότητα εντοπισμού βιοδραστικών κυκλικών πεπτιδίων τα οποία αυξάνουν το επίπεδο φθορισμού της πρωτεϊνικής χίμαιρας του Αβ με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescence Protein) GFP. Η παραγωγή της χίμαιρας και των βιβλιοθηκών των κυκλικών πεπτιδίων πραγματοποιούνται παράλληλα σε τροποποιημένα βακτήρια, ενώ η διαλογή των μεμονωμένων φθοριζόντων κλώνων επιτελείται με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής (fluorescence-activated cell sorting, FACS). Το τροποποιημένο βακτηριακό σύστημα που χρησιμοποιήθηκε, επέτρεψε τη βιοσύνθεση και τη γρήγορη διαλογή 10 εκατομμυρίων κυκλικών πεπτιδίων, καθώς και την επιλογή εκατοντάδων βιοδραστικών πεπτιδίων με εν δυνάμει ρυθμιστικό ρόλο έναντι της συσσωμάτωσης του Αβ. Από 10 αυτά, δύο πεπτίδια που έφεραν τις αλληλουχίες cyclo-SASPT και cyclo-TAFDR και ονομάστηκαν AβC5-34 και AβC5-116 αντίστοιχα, παρήχθησαν μέσω σύνθεσης και χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της δράσης τους πάνω στη συσσωμάτωση του Αβ, μέσω βιοχημικών, βιοφυσικών και βιολογικών δοκιμασιών, in vitro. Οι δοκιμασίες αυτές φανέρωσαν ότι τα συγκεκριμένα κυκλικά πεπτίδια παρεμβάλλονται στη φυσιολογική συσσωμάτωση του Αβ, οδηγώντας στο σχηματισμό μη τυπικών συσσωματώσεων οι οποίες εμφανίζουν περιορισμένη νευροτοξικότητα. Επιπλέον, η προστατευτική δράση των ΑβC5-34 και ΑβC5-116 έναντι της συσσωμάτωσης και κυτταροτοξικότητας του Αβ αξιολογήθηκαν in vivo σε διαγονιδιακά στελέχη Caenorhabditis elegans που παράγουν Αβ. Οι δοκιμασίες αυτές έδειξαν πως τα πεπτίδια AβC5-34 και AβC5-116 παρουσιάζουν προστατευτικές ιδιότητες έναντι της συσσωμάτωσης και της κυτταροτοξικότητας του Αβ. Συνεπώς, τα πεπτίδια AβC5-34 και AβC5-116 παρουσιάζουν φαρμακολογικό ενδιαφέρον ενώ η περαιτέρω αξιολόγηση και βελτιστοποίηση τους θα μπορούσε να οδηγήσει σε ενώσεις με θεραπευτικές ιδιότητες έναντι της νόσου Alzheimer. Τέλος, ο συνδυασμός στοχευμένης μεταλλαξιγένεσης και ανάλυσης DNA νέας γενιάς, επέτρεψε την ανακάλυψη των σχέσεων δομής και δραστικότητας για τον πληθυσμό των επιλεγμένων κυκλικών πεπτιδίων, καθώς και την ταυτοποίηση διακριτών οικογενειών βιοδραστικών πεπτιδίων. Η γενετικά τροποποιημένη βακτηριακή πλατφόρμα που παρουσιάζεται στη συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή εμφανίζει ορισμένα σημαντικά πλεονεκτήματα. Πρώτον, επιτρέπει εύκολη και αποτελεσματική διαλογή μοριακών βιβλιοθηκών. Δεύτερον, η ενσωμάτωση μιας μεθόδου διαλογής που στηρίζεται στο FACS, επέτρεψε γρήγορη διαλογή με αυξημένη απόδοση σε βιοδραστικά μόρια, συγκριτικά με τις συνηθισμένες τεχνικές διαλογής σε τρυβλία. Τρίτον, η προσέγγιση αυτή παρακάμπτει την ανάγκη για γνώση δομικών χαρακτηριστικών ή για την προετοιμασία συγκεκριμένων συσσωματωμάτων της Αβ. Τέλος, το βακτηριακό σύστημα που χρησιμοποιήθηκε έχει σχεδιαστεί με στόχο την παρακολούθηση της αναδίπλωσης και της συσσωμάτωσης της πρωτεΐνης-στόχου. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα η εργασία που παρουσιάζεται σε αυτή τη διατριβή να λειτουργήσει ως βάση για τη χρήση αυτού του συστήματος για άλλες πρωτεΐνες-στόχους με προβληματική 11 αναδίπλωση, οι οποίες έχουν συσχετιστεί με τις ανάλογες νόσους. Τρέχον αλλά και δημοσιευμένο ερευνητικό έργο από το εργαστήριο Ενζυμικής & Συνθετικής Βιοτεχνολογίας του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών, έχει αποδείξει πως η συγκεκριμένη πλατφόρμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην ανακάλυψη κυκλικών πεπτιδίων με βιοδραστικότητα έναντι ποικίλων πρωτεϊνικών στόχων, όπως τη μεταλλαγμένη δισμουτάση του υπεροξειδίου (SOD1), τη μεταλλαγμένη p53 και την πολυ-Q χαντινγκτίνη (polyQ-Htt).	el
heal.advisorName	Κολίσης, Φραγκίσκος	el
heal.advisorName	Σκρέτας, Γεώργιος	el
heal.advisorName	Χατζηνικολάου, Δημήτρης	el
heal.committeeMemberName	Κολίσης, Φραγκίσκος	el
heal.committeeMemberName	Σκρέτας, Γεώργιος	el
heal.committeeMemberName	Χατζηνικολάου, Δημήτρης	el
heal.committeeMemberName	Λυμπεράτος, Γεράσιμος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Ευθυμιόπουλος, Σπύρος	el
heal.committeeMemberName	Ventura, Salvador	en
heal.academicPublisher	Σχολή Χημικών Μηχανικών	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	240
heal.fullTextAvailability	true