Ανάπτυξη και μελέτη νέων πρωτεϊνικών βιοαισθητήρων μεταφοράς ενέργειας συντονισμού

Κωσταδήμα, Ελένη; Kostadima, Eleni

dc.contributor.author	Κωσταδήμα, Ελένη	el
dc.contributor.author	Kostadima, Eleni	en
dc.date.accessioned	2021-07-14T10:49:03Z
dc.date.available	2021-07-14T10:49:03Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/53621
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.21319
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Βιοαισθητήρες	el
dc.subject	Μεταφορά ενέργειας συντονισμού	el
dc.subject	Διάγνωση	el
dc.subject	Biosensors	en
dc.subject	FRET	en
dc.subject	Diagnostics	en
dc.subject	Zinc Fingers	en
dc.subject	Δάχτυλα ψευδαργύρου	el
dc.subject	Ανίχνευση λακτόζης	el
dc.subject	Lactose detection	en
dc.title	Ανάπτυξη και μελέτη νέων πρωτεϊνικών βιοαισθητήρων μεταφοράς ενέργειας συντονισμού	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.classification	Molecular biology	en
heal.classification	Μοριακή βιολογία	el
heal.language	el
heal.access	campus
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2021-02-26
heal.abstract	Οι βιοαισθητήρες που βασίζονται στη μεταφορά ενέργειας συντονισμού βιοφωταύγειας BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) αποτελούν ένα πολλά υποσχόμενο μέσο ανίχνευσης αναλυτών και χαίρουν πληθώρας πιθανών εφαρμογών σε πολλούς τομείς. H ιδιότητα αυτο-φωτισμού μέσω ενδογενούς μετατροπής χημικής ενέργειας από το μόριο – δότη BRET, καθώς και η ευκολία ποσοτικοποίησης του παραγώμενου σήματος από το μόριο – δέκτη καθιστούν την τεχνική αυτή ιδανική για αναλυτικές εφαρμογές σε σύνθετα δείγματα και χωρίς αναγκή εξωγενούς ακτινοβολίας διέγερσης. Σκοπός της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας αποτέλεσε η μελέτη δύο διαφορετικών βιοαισθητήρων βασισμένους στο σύστημα BRET, ένα βιοαισθητήρα με στόχο την ανίχνευση λακτόζης και έναν με στόχο την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων. Ως πρώτο βήμα, έγινε μελέτη μιας «βιβλιοθήκης» πρωτεϊνικών βιοαισθητήρων ανίχνευσης λακτόζης που έχουν την προοπτική χρήσης για την ανίχνευση υπολειμμάτων λακτόζης σε γάλα μειωμένης λακτόζης, για την οποία οι υπάρχουσες εργαστηριακές εφαρμογές δεν έχουν την απαιτούμενη ευαισθησία. Η βιβλιοθήκη αποτελούνταν από παραλλαγές ενός βασικού σχεδίου αισθητήρα που περιλαμβάνει την λουσιφεράση RLuc (μόριο - δότης BRET) και μια πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη GFP (μόριο – δέκτης BRET), καθώς και ένα βιολογικό στοιχείο αναγνώρισης της λακτόζης (BgaR). H σύνδεση της λακτόζης επιφερεί δομικές αλλαγές στην πρωτεΐνη που οδηγούν με τη σειρά τους στην μεταβολή της απόστασης RLuc - GFP, η οποία είναι μετρήσιμη ως μεταβολή του παραγώμενου σήματος BRET. Μέσω ανάλυσης σε μικροφασματόμετρο φθορισμού, μελετήθηκαν τα βασικά χαρακτηριστικά του κάθε βιοαισθητήρα με σκοπό την εύρεσης της παραλλαγής με τις πιο ευνοϊκές ιδιότητες για εμπορική χρήση στη βιομηχανία τροφίμων. Διαπιστώθηκε ότι το όριο ανίχνευσης των ενεργών βιοαισθητήρων (5,2 – 57,4 μM) είναι ιδανικό για χρήση ακόμα και υπό τους πιο αυστηρούς κανονισμούς για υπολείμματα λακτόζης (300 μΜ) και ότι μπορούν να εφαρμοστούν μέσω ενός απλού πρωτόκολλου με μικρό χρόνο ανάλυσης (5 λεπτά), κατάλληλο για εφαρμογή σε εργοστασιακό περιβάλλον. Οι συγκεκριμένες ιδιότητες καθιστούν την τεχνική BRET ιδιαίτερα ελκυστική για εφαρμογή και σε άλλους τομείς όπως στις διαγνωστικές αναλύσεις για την προστασία της δημόσιας υγείας. Επιχειρήθηκε λοιπόν να αντικατασταθεί η αναγνώριση λακτόζης με την αναγνώριση συγκεριμένων αλληλουχιών γενετικού υλικού με στόχο την εφαρμογή στην ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάστηκαν διμερείς αισθητήρες με δάχτυλα ψευδαργύρου, δομές που απαντόνται σε ρυθμιστικές πρωτεΐνες που συνδέονται επιλεκτικά με αλληλουχίες DNA. Στόχος ήταν η πρόσδεση των δάκτυλων ψευδαργύρου του διμερούς συστήματος και της αλληλουχίας DNA - στόχου να επιφέρει τον ανασυνδυασμό του ολοκληρωμένου βιοαισθητήρα και την παραγωγή σήματος BRET. Αρχικά, έγινε βελτιστοποίηση της έκφρασης και του καθαρισμού των πρωτεϊνικών βιοαισθητήρων, με χρήση φορέα έκφρασης με πρωτεΐνη δέσμευσης μαλτόζης (MBP). Διαπιστώθηκε ότι ενώ αρχικά οι πρωτεΐνες εκφράζονταν συσσωματομένες στο αδιάλυτο κλάσμα, μέσω ελέγχου των συνθηκών έκφρασης (θερμοκρασία, συγκέντρωση επαγωγέα και συγκέντρωση Zn2+) ήταν δυνατή η υπερέκφραση αναδιπλωμένων πρωτεϊνών καθώς και ο καθαρισμός τους μέσω χρωματογραφίας συγγένειας. Στη συνέχεια έγινε σειρά μετρήσεων για να διαπιστωθεί αν το σύστημα βιοαισθητήρων έχει την ικανότητα να ανιχνεύσει το νουκλεϊκό οξύ – στόχο. Μέσω των μετρήσεων αυτών επιβεβαιώθηκε πως το μόριο - δότης του συστήματος BRET είναι λειτουργικό. Παρ’ όλα αυτά δεν υπήρξε ξεκάθαρη ένδειξη εντοπισμού του νουκλεϊκού οξέος, πιθανόν λόγω παρεμβολής της ογκώδους MBP στον ανασυνδυασμό του διμερούς αισθητήρα. Απόπειρες αφαίρεσης της ετικέτας συγγένειας MBP μέσω δράσης προτεασών δεν ήταν επιτυχείς και για αυτό δοκιμάστηκαν φορείς έκφρασης με διαφορετικές ετικέτες συγγένειας. Η χρήση φορέα έκφρασης με ετικέτα συγγένειας πολυιστιδίνης (His-tag) και χρωματογραφία συγγένειας νικελίου δεν οδήγησε σε ικανοποιητική έκφραση και καθαρισμό, πιθανόν λόγω αλληλεπίδρασης μετάλλων, ετικέτας και δακτύλων ψευδαργύρου. Προς αναζήτηση λύσης, αναπτύχθηκε μια νέα ετικέτα συγγένειας που περιλαμβάνει βιοτινυλιωμένο σύμπλεγμα Biotin Carboxyl Carrier Protein (BCCP) από καρβοξυλάσες αυτότροφων μικροοργανισμών και έχει το πλεονέκτημα μικρού μεγέθους και υψηλής συγγένειας της βιοτίνης με ρητίνη αβιδίνης που δεν αλληλεπιδρά με τα δάκτυλα ψευδαργύρου. Η συσκεκριμένη μέθοδος οδήγησε σε υψηλή απόδοση του καθαρισμού πρωτεΐνης, θέτοντας τις βάσεις για μελλοντική εφαρμογή του βιοαισθητήρα BRET νουκλεϊκών οξέων. Συμπερασματικά, είναι εμφανές πως τα συστήματα βιοαισθητήρων που μελετήθηκαν στη συγκεκριμένη διπλωματική εργασία έχουν πολλές προοπτικές για χρήση όχι μόνο στην έρευνα αλλά και εμπορικά, σε ένα μεγάλο εύρος εφαρμογών. Ειδικά για τους βιοαισθητήρες με δάχτυλα ψευδαργύρου, οι εφαρμογές που θα μπορούσαν να έχουν στον τομέα της διάγνωσης είναι πολλές, και πιο επίκαιρες από ποτέ. Η μελέτη που έγινε στη συγκεκριμένη διπλωματική θέτει τις βάσεις για την εγκαθίδρυση αυτού του νέου συστήματος βιοαισθητήρων.	el
heal.sponsor	Research Scholarship, 2019 Australian National University, Grand Challenges Explorations (Bill and Melinda Gates Foundation) project "Just-add-water nucleic acid amplification" (Alissandratos group)	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διόμη	el
heal.committeeMemberName	Χαμηλάκης, Στυλιανός	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	85 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false