Ετερόλογη έκφραση και παραγωγή νέων βιοκαταλυτών με
ενεργότητα λυτικής μονοοξυγενάσης των πολυσακχαριτών

Μαυράκης, Ανδρέας; Mavrakis, Andreas

dc.contributor.author	Μαυράκης, Ανδρέας	el
dc.contributor.author	Mavrakis, Andreas	en
dc.date.accessioned	2021-07-29T09:36:19Z
dc.date.available	2021-07-29T09:36:19Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/53737
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.21435
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού - Μη Εμπορική Χρήση - Παρόμοια Διανομή 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού - Μη Εμπορική Χρήση - Παρόμοια Διανομή 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/gr/	*
dc.subject	Ετερόλογη έκφραση	el
dc.subject	Απομόνωση & χαρακτηρισμός ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης	el
dc.subject	AA9 LPMOs	en
dc.subject	M. thermophila	en
dc.subject	Heterologous Expression	en
dc.subject	P. pastoris	en
dc.subject	Protein purification & characterization	en
dc.title	Ετερόλογη έκφραση και παραγωγή νέων βιοκαταλυτών με ενεργότητα λυτικής μονοοξυγενάσης των πολυσακχαριτών	el
dc.title	Heterologous expression and production of new biocatalysts with Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) activity	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.classification	Χημική μηχανική	el
heal.classification	Chemical engineering	en
heal.classification	Βιοκαταλύτες	el
heal.classification	Biocatalysis	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2021-03-03
heal.abstract	Οι λυτικές μονοοξυγενάσες των πολυσακχαριτών (Lytic Polysaccharide Monooxygenases, LPMOs) αποτελούν μια νεα κατηγορία ενζύμων που έχει ανακαλυφθεί μόλις την προηγούμενη δεκαετία. Ο ρόλος τους θεωρείται πολύ σημαντικός στην αποδόμηση της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας μέσω ενός μοναδικού οξειδοαναγωγικού μηχανισμού, με την ερευνητική κοινότητα να στρέφει ολοένα και περισσότερο την προσοχή της στις LPMOs. Αποτέλεσμα της δράσης τους είναι η διάσπαση α-1,4’ ή β-1,4’ γλυκοζιτικών δεσμών και ο σχηματισμός προϊόντων με C1- ή C4- οξειδωμένα άκρα. Οι LPMOs μπορούν να αξιοποιηθούν σε αρκετές βιοτεχνολογικές εφαρμογές όπως η αύξηση της απόδοσης της αποδόμησης της βιομάζας από την συνεργιτική τους δράση με άλλα υδρολυτικά ένζυμα σε βιομηχανικές συνθήκες που απαιτούν σταθερότητα σε υψηλές θερμοκρασίες αλλά και η παραγωγή νέων καινοτόμων υλικών όπως η νανοκυτταρίνη. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτέλεσε η ετερόλογη έκφραση, η απομόνωση και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός μιας μη χαρακτηρισμένης LPMO της οικογένειας ΑΑ9 από το γονιδίωμα του θερμόφιλου μύκητα M. Thermophila. Ο μύκητας περιέχει μια μεγάλη ποικιλία γονιδίων που κωδικοποιούν υδρολυτικά ένζυμα, αναπτύσσεται βέλτιστα σε θερμοκρασίες 45-50 oC και κατά την ανάπτυξη του σε υποστρώματα λιγνινοκυτταρίνης εκκρίνει εξωκυτταρικά σε μεγάλα επίπεδα ΑΑ9 LPMOs. Η αλληλουχία MYCTH_110651, που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη που μελετάται σε αυτή την εργασία, ανασύρθηκε βιοπληροφορικά από σχετικές βάσεις δεδομένων και περιέχει την λειτουργική περιοχή πρόσδεσης υδατανθράκων CBM1 (Carbohydrate-Binding Module Family 1). Μετά από την βιοπληροφορική ανάλυση της αλληλουχίας, ακολούθησε η ετερόλογη έκφραση του γονιδίου με τη χρήση ανασυνδυασμένων πλασμιδιακών φορέων pGAPZaC στη ζύμη P. pastoris και την αξιοποίηση του υποκινητή GAP σε θρεπτικό μέσο με γλυκόζη ως πηγή άνθρακα. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη παράχθηκε σε μεγάλη ποσότητα και απομονώθηκε αποτελεσματικά σε στήλη χρωματογραφίας συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου (IMAC). Το μοριακό βάρος της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης προσδιορίστηκε ίσο με 55 kDa με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, έναντι του θεωρητικού μοριακού βάρους 34 kDa. Το παραπάνω σε συνδυασμό με τον μεγάλο αριθμό πιθανών θέσεων Ο-γλυκοζυλίωσης συνηγορούν στο συμπέρασμα ότι η P. pastoris υπεργλυκοζυλιώνει την πρωτεΐνη. Ο προσδιορισμός του ισοηλεκτρικού σημείου με ηλεκτροφόρηση IEF-PAGE έδωσε τρεις πρωτεϊνικές ζώνες σε ένα εύρος τιμών pI 5.4-6.4, κάτι το οποίο αποδίδεται στις ισομορφές ττης πρωτεΐνης που δημιουργούνται από τα διαφορετικά πρότυπα γλυκοζυλίωσης της P. pastoris κατά την μετα- μεταφραστική τροποποίηση. Από την ανάλυση προϊόντων της ενζυμικής δράσης σε δέκα πολυσακχαρίτες με χρωματογραφία εναλλαγής ιόντων HPAE-PAD, η πρωτεΐνη εμφανίζει χαρακτηριστική ενεργότητα στο υπόστρωμα κυτταρίνης διογκωμένης με φωσφορικό οξύ PASC επιβεβαιώνοντας τη βιβλιογραφία όσον αφορά την συσχέτιση της περιοχής CBM1 των ΑΑ9 με την ενεργότητα σε κρυσταλλικά υποστρώματα κυτταρίνης. Συμπληρωματικά, η LPMO φαίνεται να έχει μόνο C1-οξειδωτική δράση στην κυτταρίνη καθιστώντας τη κατάλληλη για εφαρμογές απομόνωσης νανοκυτταρίνης. Η ειδική ενεργότητα της πρωτεΐνης υπολογίστηκε ίση με 3.19 U/g σε συνθήκες pH = 6, 40 oC στο υπόστρωμα 2,6-DMP παρουσία H2O2. Οι τιμές των μεγεθών που προσδιορίστηκαν βρίσκονται σε όμοια επίπεδα με αυτά άλλων χαρακτηρισμένων ΑΑ9 LPMOs μυκητιακής προέλευσης της βιβλιογραφίας.	el
heal.abstract	Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) are a novel class of enzymes discovered recently in the previous decade. Their role is considered very important in the degradation of lignocellulose biomass through a unique redox mechanism of high scientific and industrial interest. The result of their action is the cleavage of α-1,4 'or β-1,4' glycosidic bonds and the formation of C1- or C4- oxidized products. LPMOs can be utilized in several biotechnological applications such as increasing the efficiency of biomass degradation due to their synergistic action with other hydrolytic enzymes in industrial conditions that require stability at high temperatures and the production of new innovative materials like nanocellulose. The objective of this thesis was the heterologous expression, purification and biochemical characterization of an uncharacterized LPMO of the AA9 family from the genome of the thermophilic fungus M. Thermophila. This fungus contains a wide variety of genes encoding hydrolytic enzymes, it marks optimal growth at temperatures of 45-50 oC and several genes encoding AA9 proteins are highly upregulated on lignocellulosic substrates. The MYCTH_110651 sequence, which encodes the protein, was bioinformatically retrieved and contains the functional domain CBM1 (Carbohydrate-Binding Module Family 1). Bioinformatics analysis of the sequence was followed by heterologous expression of the gene using recombinant pGAPZaC plasmid vectors in P. pastoris host by utilizing the GAP promoter with glucose as a main carbon source. The recombinant protein was produced in large quantities and effectively purified on an immobilized metal affinity chromatography column (IMAC). The molecular weight of the recombinant protein was determined 55 kDa by SDS-PAGE electrophoresis and the theoretical molecular weight was calculated 34 kDa. The above-mentioned in combination with the large number of possible Oglycosylation sites proves that P. pastoris hyperglycosylates the protein. The isoelectric point determination was held by IEF-PAGE electrophoresis and showed three protein bands in the range of 5.4-6.4 pI values. This is attributed to the protein isoforms generated by the different glycosylation patterns of P. pastoris during post-translational modification. From the analysis of products of enzymatic activity on ten polysaccharides by the HPAE-PAD chromatography method, the protein shows high levels of activity on the PASC (Phosphoric acid swollen cellulose) confirming the literature in regard to the association of the CBM1 region of AA9 with activity on crystalline cellulose substrates. Additionally, this LPMO appears to produce only C1-oxidized products on cellulose making it suitable for nanocellulose production applications. The specific activity of the protein was calculated 3.19 U/ g at pH = 6, 40 oC conditions on 2,6-DMP substrate in the presence of H2O2. The values of the above-determined properties are at similar levels to other biochemically characterized AA9 LPMOs of fungal origin in the literature.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.advisorName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Παπαθανασίου, Αθανάσιος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διομή	el
heal.committeeMemberName	Papathanasiou, Athanasios	en
heal.committeeMemberName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Mamma, Diomi	en
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	163 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false