Εξαγωγή χημικής κινητικής για τον πολλαπλασιασμό DNA σαλμονέλας από πειράματα ποσοτικής PCR

Ντόβολου, Ηλιάνα; Ntovolou, Iliana

dc.contributor.author	Ντόβολου, Ηλιάνα	el
dc.contributor.author	Ntovolou, Iliana	en
dc.date.accessioned	2021-09-02T09:54:12Z
dc.date.available	2021-09-02T09:54:12Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/53780
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.21478
dc.description	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο--Μεταπτυχιακή Εργασία. Διεπιστημονικό-Διατμηματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών (Δ.Π.Μ.Σ.)	el
dc.rights	Default License
dc.subject	Ποσοτική PCR	el
dc.subject	Πολλαπλασιασμός DNA	el
dc.subject	Ισοζύγια μάζας	el
dc.subject	qPCR	en
dc.subject	Quantitative-PCR	en
dc.subject	COMSOL	en
dc.subject	DNA multiplication	en
dc.title	Εξαγωγή χημικής κινητικής για τον πολλαπλασιασμό DNA σαλμονέλας από πειράματα ποσοτικής PCR	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Μικροσυστήματα και Νανοδιατάξεις	el
heal.language	el
heal.access	campus
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2021-04-27
heal.abstract	Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την εύρεση τιμών των παραμέτρων της κινητικής της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase chain reac-tion ή PCR) με βάση πειραματικές μετρήσεις πολλαπλασιασμού του DNA με ποσοτική PCR (quantitative-PCR, q-PCR). Η μεθοδολογία εφαρμόστηκε στον πολλαπλασιασμό DNA της σαλμονέλας, ενώ χρησιμοποιήθηκε το δίκτυο αντιδράσεων που διατυπώνεται στην εργασία του Hunicke – Smith. Τα βήματα που ακολουθήθηκαν για την υλοποίηση του σκοπού της εργασίας είναι η επιλογή της κινητικής της PCR, ο σχεδιασμός των πειραμάτων, το σύνολο των πειραματικών διαδικα-σιών και ο υπολογισμός των παραμέτρων της κινητικής μέσω προσαρμογής στις πειραματι-κές μετρήσεις με τη βοήθεια κατάλληλου αλγόριθμου βελτιστοποίησης. Αρχικά, επιλέχτηκε το δίκτυο αντιδράσεων της κινητικής που περιγράφεται στην εργασία του Hunicke – Smith και διατυπώθηκαν τα ισοζύγια μάζας για όλα τα συστατικά του δικτύου σε μεταβατική κατάσταση. Τα ισοζύγια μάζας είναι ένα σύνολο συνήθων διαφορικών εξισώσε-ων και αποτελούν το μαθηματικό μοντέλο της κινητικής, το οποίο ολοκληρώνεται ως προς τον χρόνο με χρήση του εμπορικού κώδικα του COMSOL. Πριν τον σχεδιασμό των πειραμά-των, πραγματοποιήθηκε ανάλυση ευαισθησίας των αποτελεσμάτων του πολλαπλασιασμού, στους παράγοντες και τις συνθήκες του πειράματος με χρήση της κινητικής που παρουσιάζε-ται στην εργασία του Hunicke – Smith. Η ανάλυση έδειξε ότι οι κρισιμότεροι παράγοντες ή-ταν η θερμοκρασία και ο χρόνος παραμονής στο στάδιο της επιμήκυνσης. Έτσι, κατά τη φάση σχεδιασμού των πειραμάτων, δόθηκαν περισσότερες τιμές σε αυτούς τους δύο παράγοντες. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε η επιλογή των πειραμάτων που πρέπει να διεξαχθούν με γνώμο-να το κόστος των αντιδραστηρίων και το χρόνο εκτέλεσης των πειραμάτων. Πραγματοποιή-θηκαν συνολικά 300 μετρήσεις σε 60 διαφορετικές ομάδες πειραμάτων (6 διαφορετικά πρω-τόκολλα PCR με 5 διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις του DNA, 2 διαφορετικές συγκεντρώ-σεις εκκινητών) και 5 επαναλήψεις ανά ομάδα. Τα πειράματα διεξήχθησαν στη συσκευή q-PCR LightCycler 96 της εταιρείας Roche ("Light-Cycler® 96 System). Από τη συσκευή q-PCR παρήχθησαν οι καμπύλες φθορισμού συναρτήσει των κύκλων της PCR και προσδιορίστηκαν τα σημεία διασταύρωσης (ο θερμικός κύκλος όπου το σήμα φθορισμού είναι ανιχνεύσιμο, Cp). Στη συνέχεια, κατασκευάστηκαν οι καμπύλες α-ναφοράς (standard curves) και υπολογίστηκε η απόδοση πολλαπλασιασμού του DNA και η συγκέντρωση του DNA στο Cp. Τέλος, οι τιμές των παραμέτρων της κινητικής προσαρμόστη-καν στις πειραματικές μετρήσεις. Η προσαρμογή υλοποιήθηκε με γενετικό αλγόριθμο βελτι-στοποίησης. Βιβλιογραφικά, η βελτιστοποίηση της λειτουργίας μικροδιατάξεων (μικροαντιδραστήρων) πολλαπλασιασμού του DNA γίνεται είτε με δοκιμή και σφάλμα είτε έμμεσα μέσω βελτιστο-ποίησης της θερμοκρασιακής ομοιομορφίας σε κάθε ζώνη ή των χρόνων παραμονής σε κάθε ζώνη, καθώς, στην πλειοψηφία των περιπτώσεων, δεν είναι γνωστή η κινητική του πολλα-πλασιασμού. Η γνώση της κινητικής και των τιμών των παραμέτρων της επιτρέπει την βελτι-στοποίηση και το σχεδιασμό των μικροαντιδραστήρων με κριτήριο την απόδοση του πολλα-πλασιασμού.	el
heal.abstract	The aim of this thesis is to develop a methodology for the calculation of kinetic parameters of polymerase chain reaction (PCR) based on DNA amplification measurements with quantitative PCR (q-PCR). The methodology is applied to the DNA amplification of salmonella, while the reaction set used is coming from the work of Hunicke - Smith. The steps followed to achieve the aim of the thesis are the selection of PCR chemical kinetics, the design of the experiments, the set of experimental procedures, and the calculation of the kinetic parameters of PCR through fitting to measurements of DNA amplification by a suitable optimization algorithm. First, the reaction set described in the work of Hunicke – Smith was adopted and the mass balances for all the components in the set were formulated at transient state. The latter set of ordinary differential equations constitutes the mathematical model of kinetics, which is integrated over time using the commercial code COMSOL. Prior to the design of experiments, a sensitivity analysis of DNA amplification results to the factors/conditions of the experiment was performed, based on the kinetics presented in the work of Hunicke – Smith. The analysis showed that the temperature and the residence time of the extension step were the most critical factors for amplification. Thus, more values (levels) were assigned to these two factors in the design of experiments. To reduce the time for the experiments and the cost of the reactants, the designing yielded into 300 measurements for 60 groups of experiments (6 different PCR protocols with 5 different initial DNA concentrations, 2 different primer concentrations) and 5 repeats per group. The experiments were performed in Roche's q-PCR LightCycler 96 ("LightCycler® 96 System). The fluorescent signal versus the number of PCR cycles were extracted for each experiment and the crossing points (Cp, number of cycles required for the fluorescent signal to cross a given value threshold) were calculated. The standard curves were constructed and the yield of DNA amplification as well as the concentration of DNA at Cp were calculated. Finally, the kinetic parameters were adjusted to the measurements. The fitting was implemented with a genetic optimization algorithm. In the literature, the optimization of microfluidic devices (microreactors) of DNA amplification is made either by trial and error or implicitly by the optimization of the temperature uniformity and/or the residence time in each thermal zone, as in the great majority of cases the kinetics of DNA amplification is not known. The knowledge of the kinetics and the values of the kinetic parameters allow for the explicit optimization of the microreactors in terms of DNA amplification efficiency.	en
heal.advisorName	Κόκκορης, Γεώργιος	el
heal.committeeMemberName	Κόκκορης, Γεώργιος	el
heal.committeeMemberName	Τσερέπη, Αγγελική	el
heal.committeeMemberName	Μαθιουλάκης, Δημήτριος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Εφαρμοσμένων Μαθηματικών και Φυσικών Επιστημών	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	137σ.	el
heal.fullTextAvailability	false