Utilization of lignocellulosic biomass and biowaste for the production of high added-value metabolites from  microalgae

Χαλιμά, Αγγελική Ελένη

dc.contributor.author	Χαλιμά, Αγγελική Ελένη
dc.date.accessioned	2021-12-22T09:19:18Z
dc.date.available	2021-12-22T09:19:18Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/54238
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.21936
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	βιομετατροπή, μικροφύκη, ω-3 λιπαρά οξέα, υγρό κλάσμα σκοτεινής ζύμωσης, υδρολύματα	el
dc.subject	bioconversion, microalgae, omega-3 fatty acids, dark fermentation liquid fraction, hydrolysates	en
dc.title	Utilization of lignocellulosic biomass and biowaste for the production of high added-value metabolites from microalgae	en
dc.title	Αξιοποίηση λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας και βιοαποβλήτων για την παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας με τη χρήση μικροφυκών	el
dc.contributor.department	Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.type	doctoralThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	en
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2021-07-07
heal.abstract	Σκοπός της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής ήταν ο σχεδιασμός και η εγκαθίδρυση βιοδιεργασιών, με προοπτική βιομηχανικής εφαρμογής, που επιτρέπουν την κατανάλωση του οργανικού περιεχομένου ρευμάτων αποβλήτων και την παράλληλη αξιοποίησή του για την παραγωγή μεταβολιτών μικροφυκών, υψηλής διατροφικής αξίας. Τα μικροφύκη αποτελούν μια κατηγορία μικροοργανισμών, ορισμένοι εκ των οποίων είναι γνωστοί και ευρέως χρησιμοποιούμενοι για την ικανότητα συσσώρευσης ωμέγα-3 λιπαρών οξέων. Τα ω-3 λιπαρά οξέα αποτελούν απαραίτητο, λειτουργικό συστατικό της ανθρώπινης διατροφής, ενώ οι πηγές πρόσληψης είναι περιορισμένες. Συνεπώς διακρίνονται από αυξημένη ζήτηση και υψηλό κόστος πώλησης. Η συνδυασμένη μείωση απόβλητων ουσιών, στα πλαίσια της βιοεξυγίανσης, με τη μέγιστη δυνατή παραγωγή ενός προϊόντος προστιθέμενης αξίας αποτέλεσε την κεντρική ιδέα της διατριβής. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε ενδελεχής βιβλιογραφική ανασκόπηση για την εύρεση και προμήθεια ενός στελέχους μικροφύκους ικανού να αναπτύσσεται σε πληθώρα υποστρωμάτων και να παράγει το ω-3 λιπαρό οξύ, εικοσιδύοεξανοϊκό οξύ, σε μεγάλο ποσοστό του συνολικού λίπους του κυττάρου. Το έλαιο μικροφυκών πλούσιο σε εικοσιδύοεξανοϊκό είναι απαραίτητο συστατικό βρεφικών σκευασμάτων, στα οποία η εναλλακτική χρήση ιχθυελαίου έχει αποδειχτεί βλαβερή. Το μικροφύκος Crypthecodinium cohnii ATCC 30772 επιλέχθηκε και αναπτύχθηκε σε διαφορετικά οργανικά οξέα που αποτελούν προϊόν αναερόβιας, σκοτεινής ζύμωσης βιοαποβλήτων, καθώς και σε απλά σάκχαρα που προκύπτουν ως προϊόντα υδρόλυσης γεωργικών υπολειμμάτων. Η επιτυχής ανάπτυξη των κυττάρων, ύστερα από κατανάλωση του συνολικού διαθέσιμου οργανικού φορτίου και εκχύλιση ελαίου, πλούσιου σε ω-3, επιβεβαίωσε την καταλληλότητα του στελέχους. Το εμπόδιο της τοξικότητας των οργανικών οξέων σε υψηλές συγκεντρώσεις παρακάμφθηκε με την εφαρμογή καλλιεργειών ημιδιαλλείποντος έργου σε βιοαντιδραστήρες εργαστηριακής κλίμακας. Στη συνέχεια, το στέλεχος αναπτύχθηκε επιτυχώς σε διήθημα υγρών κλασμάτων επεξεργασμένου βιοαποβλήτου, προερχόμενα από βέλγικη μονάδα επεξεργασίας λυμάτων, σε καλλιέργεια ημιδιαλλείποντος έργου με συνθήκες σταθερού pH. Ακολούθησαν προσπάθειες βελτιστοποίησης των συνθηκών και της μεθόδου καλλιέργειας με σκοπό την αύξηση της τελικής παραγωγής ωμέγα-3 λιπαρού οξέος. Οι προσπάθειες αυτές βασίστηκαν αφενός στην εξέταση ξεχωριστών παραμέτρων καλλιέργειας και αφετέρου στην μελέτη των συνεπειών της συνδυαστικής μεταβολής ορισμένων εξ αυτών για την εξαγωγή ενός μαθηματικού μοντέλου προσδιορισμού της παραγωγής ω-3, με χρήση της μεθοδολογίας αποκριτικών επιφανειών. Αποδεικνύεται πως ο ρυθμός αερισμού, καθώς και η πηγή και η ποσότητα αζώτου, αποτελούν σημαντικές παραμέτρους για τη συσσώρευση ωμέγα-3 λιπαρών από τα κύτταρα. Παράλληλα, στα πλαίσια της βιομετατροπής λιγνοκυτταρινούχων αποβλήτων, επιδιώχθηκε η ανάπτυξη του ίδιου στελέχους σε απλά σάκχαρα προερχόμενα από υδρολύματα, προκειμένου να διαπιστωθεί η προοπτική εφαρμογής του C. cohnii σε ένα βιοδιυλιστήριο δεύτερης γενιάς. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επιτυχώς σε υδρολύματα βιομάζας πεύκου και οξιάς προκατεργασμένων με την τεχνική της υδρολυτικής κλασμάτωσης (organosolv), υπό διαφορετικές συνθήκες, ωστόσο διαπιστώθηκε ευαισθησία στη συσσώρευση παρεμποδιστών. Τα λιγνοκυτταρινούχα υποστρώματα προεπεξεργασμένα με τη χρήση των οργανικών διαλυτών αιθανόλη και τετραϋδροφουράνιο, υπό ήπιες συνθήκες, ευνόησαν την παραγωγή ωμέγα-3 λιπαρών από την κατανάλωση των εν λόγω υδρολυμάτων. Στην περίπτωση όλων των κατηγοριών αποβλήτων που εξετάστηκαν- οργανικών οξέων και υδρολυμάτων-, προέκυψε το συμπέρασμα πως η ενίσχυση του διαθέσιμου οργανικού φορτίου προς κατανάλωση, επιδρά θετικά στην τελική παραγωγή βιομάζας και ωμέγα-3. Όσον αφορά τα υδρολύματα λιγνοκυτταρινούχων αποβλήτων, η προσπάθεια ενίσχυσης της απόδοσης της υδρόλυσης οδήγησε στην ετερόλογη έκφραση και το χαρακτηρισμό ενός νέου ενζύμου της κατηγορίας των λυτικών πολυσακχαριτικών μονοοξυγενασών από το θερμόφιλο μύκητα Thermothelomyces thermophila ATCC 42464. Τα εν λόγω ένζυμα έχουν την ικανότητα να ενισχύουν την ενζυμική υδρόλυση λιγνοκυτταρινούχων υποστρωμάτων με τη δημιουργία οξειδωμένων πολυσακχαριτικών αλυσίδων που διασπώνται στη συνέχεια από γλυκόζυλο-υδρολάσες. Έτσι προκύπτει περίσσεια απλών σακχάρων στο τελικό υγρό, η οποία μπορεί να αξιοποιηθεί για την αυξημένη ανάπτυξη των καλλιεργήσιμων μικροφυκών και την επιπλέον παραγωγή ελαίου. Η πρωτεΐνη επέδειξε την ικανότητα οξείδωσης του β-1,4-γλυκοζιτικού δεσμού πολύ- και ολιγο-σακχαριτών της κυτταρίνης, καθώς και τη δυνατότητα συνεργιστικής δρασης σε συνδυασμό με το ευρέως χρησιμοποιούμενο εμπορικό σκεύασμα Cellic® CTec2. Η ενίσχυση της υδρόλυσης με χρήση νέων ενζύμων αποτελεί κρίσιμο βήμα για την αποδοτικότερη μετατροπή της λιγνοκυτταρίνης σε ω-3 λιπαρά, καθώς αποδείχθηκε πως το εξεταζόμενο μικροφύκος δεν έχει το ίδιο την ικανότητα έκκρισης κυτταρινολυτικών ενζύμων για την κάλυψη των διατροφικών του αναγκών. Εν κατακλείδι, η διατριβή περιελάμβανε μελέτες βελτιστοποίησης της βιομετατροπής του βλαβερού οργανικού φορτίου διαφορετικών ρευμάτων αποβλήτων σε υψηλής λειτουργικής αξίας, ωμέγα-3 λιπαρά οξέα, βασισμένες, τόσο στην εφαρμογή των κατάλληλων συνθηκών της διεργασίας καλλιέργειας, όσο και στην εξασφάλιση ενός πλούσιου σε θρεπτικά συστατικά ρεύματος τροφοδοσίας, προερχόμενου από επεξεργασία αποβλήτων.	el
heal.abstract	The PhD thesis aimed at the development of sustainable biotechnological processes of industrial potential, which will allow the depletion of environmentally polluting organic content of biowaste and lignocellulosic biomass, coupled with the subsequent production of high-added value metabolites from microalgae. Microalgae comprise a vast category of microorganisms, some of which are known for their ability to accumulate omega-3 fatty acids, a necessary component of human diet of limited availability. Therefore, the main idea of the thesis included the optimization of omega-3 production, coupled with the consumption of waste material, through microalgae bioconversion. Initially, the scientific work carried out included the screening of literature for the disclosure of a microalgae species with high potential as means of bioconversion of agricultural and municipal waste to omega-3 fatty acids. The strain chosen, namely Crypthecodinium cohnii ATCC 30772, was examined in the laboratory regarding its ability to grow by assimilating different volatile organic acids, present in the liquid fraction of anaerobically pretreated biowaste, or simple sugars released from the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic residues. The chosen microorganism responded favorably by assimilating the total available organic content of each waste feed, while the produced microalgal biomass was rich in the omega-3 fatty acid, docosahexaenoic acid, a functional product of high nutritional and economic value. Demand for microalgal oil, rich in docosahexaenoic acid, is especially high in cases of infant formulas production, where the alternative of fish oil derived omega-3 has been deemed harmful and inappropriate. The inhibitory effect of high volatile organic acid concentration inside the cultivation vessel was eliminated by adopting a fed-batch, pH-auxostat cultivation mode in lab-scale bioreactors. Moreover, the strain was successfully cultivated in fed-batch cultures with a feed of a real biowaste effluent, from an operating Belgian treatment plant. The evaluation of the accumulation of omega-3 fatty acid under different cultivation conditions was carried out, to enable the researcher to study the responses of the strain to variable cultivation techniques, as well as to different feed compositions. The determination of the optimum fermentation conditions, which allow harvesting of the highest amount of omega-3 fatty acids, was completed both by separate examination of the experimental results of each condition and by preparing a mathematical model to predict the docosahexaenoic acid production under specific fed-batch fermentation conditions, through response surface methodology. The aeration rate and nitrogen source and availability were found to be critical parameters regarding the docosahexaenoic acid accumulation. At the same time, the assimilation of hydrolysate-derived monosaccharides by the same strain was also evaluated in an attempt to integrate the microalga in a second generation biorefinery concept. The cells were able to grow both on pentoses and hexoses of beechwood and pine hydrolysates, but exhibited a sensitivity to inhibitors released during biomass pretreatment. Organosolv pretreatment under mild conditions with ethanol or tetrahydrofuran was proven more effective in producing a lignocellulosic material with higher potential as substrate for bioconversion. In the case of both waste-derived streams examined- that is the liquid fraction of dark fermentation of biowaste and lignocellulosic hydrolysates- it was concluded, that an enhancement of the carbon content of the feed is favorable for a higher biomass and DHA recovery. Regarding lignocellulosic biomass as carbon source for the growth of the microalga, attempts to enhance the hydrolysis performance, included also the heterologous production and characterization of a new enzyme from the thermophilic fungus Thermothelomyces thermophila ATCC 42464, belonging in the category of lytic polysaccharide monooxygenases. These enzymes are known for assisting the action of glycosyl hydrolases by generating oxidized polysaccharide chains and enhancing the final sugar content of the liquid to be used for bioconversion purposes. The enzyme successfully oxidatively cleaved the β-1,4-bond of poly- and oligo-saccharides of cellulose and exhibited synergy with the commercial enzyme mixture Cellic® CTec2 in glucose generation from pretreated biomass. Enhancement of the hydrolysis efficiency with newly discovered enzymes is a critical step towards the increased bioconversion of lignocellulose to omega-3 fatty acids, since the examined strain wasn’t able to secrete cellulolytic enzymes for itself, to support its nutrition needs by directly assimilating lignocellulosic substrates. In conclusion, this PhD thesis includes the research conducted in order to optimize the bioconversion of polluting organic content of various waste streams to functional omega-3 fatty acids by microalgae. This was based not only on the application of the best cultivation conditions for each feed, but also on the establishment of waste-derived feeds, rich in nutrients, for microalgal growth.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος
heal.committeeMemberName	Κροκίδα, Μαγδαληνή
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διομή
heal.committeeMemberName	Ταούκης, Πέτρος
heal.committeeMemberName	Δημαρόγκωνα, Μαρία
heal.committeeMemberName	Χατζηνικολάου, Δημήτριος
heal.academicPublisher	Σχολή Χημικών Μηχανικών	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.fullTextAvailability	false