Χαρακτηρισμός καινοτόμων βιοκαταλυτών και μελέτη της συνεργιστικής τους δράσης σε υποστρώματα ξυλάνης

Παγουρτζή, Χριστίνα; Pagourtzi, Christina

dc.contributor.author	Παγουρτζή, Χριστίνα	el
dc.contributor.author	Pagourtzi, Christina	en
dc.date.accessioned	2022-01-21T17:55:27Z
dc.date.available	2022-01-21T17:55:27Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/54405
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.22103
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Αραβινοφουρανοζιδάση	el
dc.subject	Εστεράση του οξικού οξέος	el
dc.subject	Συνεργιτισμοί	el
dc.subject	Ξυλάνη	el
dc.subject	Βιομάζα	el
dc.subject	Arabinofuranosidase	el
dc.subject	Acetyl esterase	en
dc.subject	Synergism	en
dc.subject	Xylan	en
dc.subject	Biomass	en
dc.title	Χαρακτηρισμός καινοτόμων βιοκαταλυτών και μελέτη της συνεργιστικής τους δράσης σε υποστρώματα ξυλάνης	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιομηχανική Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2021-10-07
heal.abstract	Στην παρούσα διπλωματική εργασία δόθηκε ιδιαίτερη έμφαση στην ενζυμική υδρόλυση της ξυλάνης, η οποία αποτελεί δομικό συστατικό της λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας. Η υψίστου βαθμού σημασία αυτής της διαδικασίας υποδεικνύεται από τις πολυάριθμες εφαρμογές των μονομερών της ξυλάνης κατά την παραγωγή βιοκαυσίμων, βιοπλαστικών και προϊόντων προστιθέμενης αξίας, στοχεύοντας έτσι στη μείωση των περιβαλλοντικών επιπτώσεων και στην κυκλική βιοοικονομία. Πιο συγκεκριμένα, έγινε πλήρης βιοχημικός χαρακτηρισμός δύο καινοτόμων ενζύμων προερχόμενων από τον μύκητα Thermothelomyces thermophilus, μίας αραβινοφουρανοζιδάσης της οικογένειας των γλυκοζιδικών υδρολασών GH43 (TtAbf43) καθώς και μίας εστεράσης του οξικού οξέος η οποία ανήκει στην οικογένεια των υδατανθρακικών εστερασών CE16 (TtCE16). Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η συνεργιστική δράση των προαναφερθέντων ενζύμων με διαφορετικές ξυλανάσες με σκοπό την μελέτη του μηχανισμού δράσης τους. Αναφορικά με την αραβινοφουρανοζιδάση TtAbf43, βρέθηκε πως οι βέλτιστες συνθήκες δράσης της είναι το pH 5 και η θερμοκρασία 65℃. Η TtAbf43 διατηρεί το 80% της ενεργότητά της μετά από εικοσιτετράωρη επώαση σε ένα εύρος τιμών pH 2-9 και σε θερμοκρασίες έως και 50℃. Οι κινητικές παράμετροι ΚΜ και umax για την TtAbf43 είναι ίσες με 5,78±0,60 mg/ml και 0,0234±0,0009 mg/(ml∙min) ως προς το υπόστρωμα αραβινοξυλάνης σιταριού και 3,62±0,67 mg/ml και 0,0175±0,0010 mg/(ml∙min) ως προς την αραβινοξυλάνη σίκαλης. Παρουσία οργανικών διαλυτών (μεθανόλης, αιθανόλης, 1,4-διοξάνης και DMSO) σε περιεκτικότητα 10% v/v ενισχύεται η δράση του ενζύμου, ενώ σε περιεκτικότητα 45% v/v το παρεμποδίζουν. Επιπρόσθετα, η ενεργότητα της TtAbf43 δεν επηρεάζεται παρουσία της πλειονότητας των διαλυμάτων αλάτων που μελετήθηκαν (MgSO4, ZnCl2, KCl, CoCl2, CaCl2, MnCl2, NiCl2, FeCl3 και FeSO4) σε συγκεντρώσεις 0,5 mM και 1 mM, εντούτοις σημαντική παρεμπόδισή της προκαλείται παρουσία 10 mM NiCl2 και 5 mM FeCl3. Επιπλέον, όσον αφορά τον μηχανισμό δράσης της αραβινοφουρανοζιδάσης TtAbf43 βρέθηκε πως κόβει μία από τις δύο υποκαταστάσεις αραβινόζης από διπλά υποκατεστημένα μόρια ξυλόζης. Το εν λόγω ένζυμο εμφάνισε ενεργότητα στα τεχνητά υποστρώματα 4-νιτροφαίνυλ οξικό,4-νιτροφαίνυλ α-L-ραμνοπυρανόζη, 4-νιτροφαίνυλ α-L-αραβινοφουρανόζη και 2-νιτροφαίνυλ β-D-ξυλοπυρανόζη, καθώς και σε πολυμερικά υποστρώματα αραβινοξυλάνης σιταριού και σίκαλης. Όσον αφορά την TtCE16, εμφάνισε βέλτιστη δράση σε pH 6 και θερμοκρασία 45℃. Το ένζυμο διατηρεί την ενεργότητά του κατόπιν εικοσιτετράωρης επώασης σε pH 6 και 7 όπως επίσης και στους 45℃. Επιπλέον, οι κινητικές παράμετροι ΚΜ και umax της TtCΕ16 είναι ίσες με 0,042±0,002 mM και 0,038±0,000 μmol/(min∙ml) ως προς το υπόστρωμα 4-νιτροφαίνυλ οξικό. Παρουσία οργανικών διαλυτών (αιθανόλης, 1,4-διοξάνης και DMSO) σε περιεκτικότητα 10% v/v ενισχύεται η δράση της, σε αντίθεση με τη μεθανόλη που φαίνεται να μην έχει επίδραση στην ενεργότητα της TtCE16. Αντίθετα, σε περιεκτικότητα 45% v/v όλοι οι διαλύτες την παρεμποδίζουν. Ακόμη, παρουσία των διαλυμάτων αλάτων που προαναφέρθηκαν σε συγκεντρώσεις 0,5 mM και 1 mM δεν επηρεάζεται η ενεργότητα της TtCE16, ωστόσο όταν βρίσκονται σε συγκέντρωση 10 mM προκαλούν παρεμπόδιση. Η TtCE16 είχε δράση στα υποστρώματα 4-νιτροφαίνυλ οξικό, 4-νιτροφαίνυλ βουτυρικό, 4-νιτροφαίνυλ παλμιτικό, 2-νιτροφαίνυλ οξικό καθώς και σε ακετυλιωμένη ξυλάνη η οποία είχε προκατεργαστεί με ξυλανάση της οικογένειας GH10. Επιπλέον, μελετήθηκε η συνεργιστική δράση της TtAbf43 με μία ξυλανάση της οικογένειας GH30 (TtXyn30A) και παρατηρήθηκε βαθμός συνεργιτισμού 5,0±2,3 ως προς την απελευθέρωση αραβινόζης από φυσικό υπόστρωμα ξυλάνης από ξύλο οξιάς προκατεργασμένη με υγρή οξείδωση. Ακόμη, κατά τον συνδυασμό της TtAbf43, με τις ξυλανάσες των οικογενειών GH30 και GH10 (E-XYLATM) σε υπόστρωμα στελεχών αραβοσίτου προκατεργασμένα με έκρηξη ατμού παρατηρήθηκε βαθμός συνεργιτισμού 1,4±0,2 ως προς την απελευθέρωση ξυλόζης και 1,4±0,2 ως προς την αραβινόζη. Τέλος, βαθμός συνεργιτισμού 1,3±0,1 προέκυψε και κατά την ταυτόχρονη δράση της TtCE16 και της ξυλανάσης TtXyn30A προς απελευθέρωση ξυλοβιόζης και 1,5±0,1 προς την απελευθέρωση οξικού οξέος.	el
heal.abstract	This diploma thesis emphasize on the hydrolysis of xylan which is a building block of lignocellulosic biomass. The outstanding importance of this process is indicated by the numerous applications of xylan’s monomers in the production of biofuels, bioplastics and value-added products, aiming to a reduction of the environmental impact towards a circular bioeconomy. More specifically, two innovative enzymes from the fungus Thermothelomyces thermophilus were biochemically characterized, a GH43 arabinofuranosidase (TtAbf43) as well as a CE16 acetyl esterase (TtCE16). Additionally, the synergistic relationship between the aforementioned enzymes with commercial xylanases was studied aiming to a better understanding of their mode of action. Regarding the arabinofuranosidase TtAbf43, it was found that its optimal action conditions are pH 5 and 65 ℃. TtAbf43 retains 80% of its activity after 24 hours of incubation at a range of pH 2-9 and temperatures up to 50 ℃. The kinetic parameters KM and umax are 5,78 mg/ml and 0,0234 mg/(ml∙min) for wheat arabinoxylan and 3,62±0,67 mg/ml and 0,0175±0,0010 mg/(ml∙min) for rye arabinoxylan. In the presence of organic solvents (methanol, ethanol, 1,4-dioxane and DMSO) at a content of 10% v/v the activity of the enzyme is enhanced, while in the presence of 45% v/v is completely inhibited. In addition, the activity of TtAbf43 is not affected in the presence of the majority of the salt solutions that were studied (MgSO4, ZnCl2, KCl, CoCl2, CaCl2, MnCl2, NiCl2, FeCl3 and FeSO4) at concentrations of 0.5 mM and 1 mM. However, significant inhibition is caused by the presence of 10 mM NiCl2 and 5 mM FeCl3. Moreover, regarding the mechanism of action of arabinofuranosidase TtAbf43, it was found that it cleaves one out of the two arabinose substitutions from double substituted xylose residues. This enzyme showed activity in the artificial substrates p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl α-L-rhamnopyranoside, p-nitrophenyl α-L-arabinofuranoside and o-nitrophenyl β-D-xylopyranoside, as well as in polymeric substrates of wheat and rye arabinoxylans. Additionally, TtCE16 showed optimal activity at pH 6 and 45 ℃. The enzyme maintains its activity after twenty-four hours of incubation at pH 6 and 7 as well as at 45 ℃. In addition, the kinetic parameters KM and umax of TtCE16 are equal to 0,042±0,002 mM and 0,038±0,000 μmol/(min∙ml) for p-nitrophenyl acetate. The presence of organic solvents (ethanol, 1,4-dioxane and DMSO) at a content of 10% v/v enhances its action, while methanol seems to have no effect on the activity of TtCE16. In contrast, all solvents inhibit its action at a concentration of 45% v/v. Furthermore, the presence of the salt solutions mentioned above at concentrations of 0.5 mM and 1 mM does not affect the activity of TtCE16, although when they are present at a concentration of 10 mM they cause inhibition. TtCE16 acted on substrates p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl butyrate, p-nitrophenyl palmitate, 2-nitrophenyl acetate as well as on acetyl xylan which had been pretreated with a xylanase of the GH10 family. Furthermore, the synergistic relationship between TtAbf43 and TtXyn30A was studied and a synergistic degree of 5.0 ± 2.3 was observed, regarding the release of arabinose from a natural beechwood xylan substrate pretreated with liquid oxidation. Also, the combined action of TtAbf43 with the xylanases TtXyn30A and E-XYLATM on corn substrate pretreated with steam explosion, showed a degree of synergy of 1.4 ± 0.2 regarding the release of xylose and 1.4 ± 0, 2 with respect to arabinose. Finally, a degree of synergy of 1.3 ± 0.1 was obtained during the simultaneous action of TtCE16 and xylanase TtXyn30A concerning the release of xylobiose and 1.5 ± 0.1 of acetic acid.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Καραντώνης, Αντώνης	el
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διομή	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	116 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false