Ενζυμική τροποποίηση γλυκοζιτών στεβιόλης με βιοκαταλύτες βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος

Mohammadi, Milad

dc.contributor.author	Mohammadi, Milad	en
dc.date.accessioned	2022-02-10T09:27:07Z
dc.date.available	2022-02-10T09:27:07Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/54648
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.22346
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Στεβιοσίδη	el
dc.subject	Γλυκαντικό	el
dc.subject	Τρανσγλυκοζυλίωση	el
dc.subject	β-ξυλοζιδάση	el
dc.subject	β-γλυκανάση	el
dc.subject	Stevioside	en
dc.subject	Sweetener	en
dc.subject	Transglycosylation	en
dc.subject	β-xylosidase	en
dc.subject	β-glucanase	en
dc.title	Ενζυμική τροποποίηση γλυκοζιτών στεβιόλης με βιοκαταλύτες βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιομηχανική βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	campus
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2021-10-06
heal.abstract	Λόγω της μεγάλης γλυκύτητας και της χαμηλής περιεκτικότητας σε θερμίδες, οι γλυκοζίτες στεβιόλης του φυτού Stevia rebaudiana Bertoni έχουν κεντρίσει πολύ το ενδιαφέρον ως φυσικά γλυκαντικά και υποκατάστατα της ζάχαρης. Ωστόσο, η χρήση τους ως γλυκαντικά έχει περιοριστεί λόγω της πικρής επίγευσής τους. Η ενζυμική τροποποίηση των γλυκοζιτών στεβιόλης είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για τη βελτίωση της γεύσης τους. Σε αυτή την μελέτη, εξετάστηκε η ικανότητα τρανσγλυκοζυλίωσης του stevioside από δυο διαφορετικά ένζυμα. Το πρώτο ένζυμο που χρησιμοποιήθηκε ήταν η RcXyl39A, μια νέα β-ξυλοζιδάση (GH39) από το Ruminiclostridium cellulolyticum, η οποία εκφράστηκε, απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε στην ίδια μελέτη. Το ένζυμο παρουσιάζει βέλτιστη ενεργότητα σε pH 6.0 και θερμοκρασία 60°C με κινητικές σταθερές KM και Vmax ίσες με 1.97 ± 0.26 mM και 44.9 ± 2.3 Units/mg για το υπόστρωμα p-Nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, αντίστοιχα. Ύστερα από το βιοχημικό χαρακτηρισμό, η RcXyl39A δοκιμάστηκε σε συνδυασμό με δυο β-ξυλανάσες, τη β-ξυλανάση GH10 από Fusarium oxysporum και TtXyn30A (GH30) από τον Thermothelomyces thermophila, για την τρανσγλυκοζυλίωση του stevioside με ξυλάνη ως δότη. Και στις δυο περιπτώσεις, ανιχνεύθηκαν τρανσγλυκοζυλιωμένα παράγωγα του stevioside με υγρή χρωματογραφία HPLC. Η μέγιστη μετατροπή του stevioside υπολογίστηκε ίση 6.9 ± 1.2% για τον συνδυασμό β-ξυλανάση GH10/RcXyl39A και 9.9 ± 1.5% για το σύστημα TtXyn30A/RcXyl39A. Μελετήθηκε επίσης η επίδραση του χρόνου επώασης και των δυο ενζυμικών συστημάτων στην αύξηση της απόδοσης. Παράλληλα, εξετάστηκε η ικανότητα τρανσγλυκοζυλίωσης του καθαρού stevioside από το εμπορικό ένζυμο Finizym 250L, μια β-γλυκανάση, με β-γλυκάνη ως δότη των μονάδων γλυκοζυλίου. Από την ανάλυση HPLC ανιχνεύτηκε ένα γλυκοζυλιωμένο παράγωγο του stevioside. Με σκοπό την βελτιστοποίηση της αντίδρασης, μελετήθηκαν τρεις παράμετροι όπως ο χρόνος επώασης, η συγκέντρωση του ενζύμου και της β-γλυκάνης. Η μέγιστη μετατροπή 18.1 ± 2.2% του stevioside επιτεύχθηκε μετά από 24 ώρες με συγκέντρωση ενζύμου 0.10 mg/mL αντίδρασης και 1.5% w/v β-γλυκάνης. Τελικά, η μελέτη προτείνει μια νέα εφαρμογή της ξυλάνης ως υπόστρωμα δότη της αντίδρασης τρανσγλυκοζυλίωσης του stevioside και αποδεικνύει ότι η β-γλυκανάση και η β ξυλοζιδάση μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ενζυμική τροποποίηση του stevioside. Η β-ξυλοζιδάση RcXyl39A θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για σχεδιασμό πράσινων διεργασιών τροποποίησης γλυκοζιτών στεβιόλης αξιοποιώντας την λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα ως φθηνό υπόστρωμα δότη.	el
heal.abstract	Due to their high sweetness and low-calorie content, the steviol glycosides of the plant Stevia rebaudiana Bertoni have gained a lot of interest as natural sweeteners and sugar alternatives. However, their use has been limited because of their bitter aftertaste. Enzymatic modification of steviol glycosides is a promising tool to improve their taste. In this study, the transglycosylation of stevioside was examined by two different enzymes. The first enzyme was RcXyl39A, a novel β-xylosidase (GH39) from Ruminiclostridium cellulolyticum, which was expressed, isolated, and characterized in the same study. This enzyme exhibits optimal activity at pH 6.0 and 60°C with kinetic constants KM and Vmax equal to 1.97 ± 0.26 mM and 44.9 ± 2.3 Units/mg for the p-Nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, respectively. The recombinant enzyme was then tested in combination with two β-xylanases, β-xylanase (GH10) from Fusarium oxysporum and TtXyn30A (GH30) from Thermothelomyces thermophila, for transglycosylation reaction of stevioside with xylan as donor substrate. In both cases, transglycosylated derivatives of stevioside were detected by liquid chromatography (HPLC). The maximum conversion of stevioside achieved was 6.9 ± 1.2% for β-xylanase GH10/RcXyl39A and 9.9 ± 1.5% for the TtXyn30A/RcXyl39A. The effect of incubation time of both enzymatic systems was studied to increase the conversion yield. At the same time, the transglycosylation of pure stevioside was studied with the commercial enzyme Finizym 250L, a β-glucanase, with β-glucan as a donor of glycosyl units. A glycosylated derivative of stevioside was detected by HPLC analysis. In order to optimize the reaction yield, three parameters (incubation time, enzyme concentration and β-glucan) were studied. Maximum conversion of 18.1 ± 2.2% of stevioside was achieved after 24 hours with an enzyme concentration of 0.10 mg/mL and 1.5% w/v β-glucan. Finally, the study proposes a novel application of xylan as the donor substrate for the transglycosylation reaction of stevioside and shows that β-glucanase and β-xylosidase can be used for enzymatic modification of stevioside. RcXyl39A could be used in the future to design new green processes for enzymatic modification of steviol glycoside, by utilizing lignocellulose biomass as a cheap donor substrate.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διομή	el
heal.committeeMemberName	Κορδάτος, Κωνσταντίνος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	75 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false