Ανακάλυψη & Βελτιστοποίηση ετερόλογης έκφρασης πολυεστερασών με δυνατότητα αποικοδόμησης πλαστικών

Μακρυνιώτης, Κωνσταντίνος; Makryniotis, Konstantinos

dc.contributor.author	Μακρυνιώτης, Κωνσταντίνος	el
dc.contributor.author	Makryniotis, Konstantinos	en
dc.date.accessioned	2022-02-11T19:26:27Z
dc.date.available	2022-02-11T19:26:27Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/54703
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.22401
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Βιοαποικοδόμηση	el
dc.subject	Πολυεστεράσες	el
dc.subject	Τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο	el
dc.subject	Πλαστικά	el
dc.subject	Biodegradation	en
dc.subject	Polyethylene terephthalate	en
dc.subject	Heterologous expression	en
dc.subject	Plastics	el
dc.subject	Ετερόλογη έκφραση	el
dc.subject	Polyesterases	en
dc.title	Ανακάλυψη & Βελτιστοποίηση ετερόλογης έκφρασης πολυεστερασών με δυνατότητα αποικοδόμησης πλαστικών	el
dc.title	Discovery & Enhancement of heterologous expression of polyesterases capable to degrade plastics	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2021-10-06
heal.abstract	Η παρούσα ερευνητική μελέτη είχε ως στόχο την ανακάλυψη ενζύμων με ικανότητα διάσπασης συμβατικών πολυεστερικών πλαστικών. Για την επίτευξη αυτού, μελετήθηκαν δώδεκα πολυεστεράσες σε εφτά διαφορετικά πολυεστερικά υποστρώματα. Από τα μελετώμενα ένζυμα, τα οκτώ (FoCut, HiC, LCC, PETase, PHAase, PHOase, PLAase και PUase) εντοπίστηκαν βιβλιογραφικά και επιλέχθηκαν λόγω των σημαντικών ενδείξεων αποικοδόμησης διαφορετικών πολυεστέρων. Συγκεκριμένα οι πολυεστεράσες PETase και LCC είναι γνωστές υδρολάσες του τερεφθαλικού πολυαιθυλενίου (PET). Τα δύο ένζυμα, Dmest και Se1JFR, ανακαλύφθηκαν με την χρήση βιοπληροφορικού εργαλείου (BLAST®), αναζητώντας αλληλουχίες υψηλής ομολογίας με αυτές των προαναφερθέντων PET-υδρολασών. Τα υπόλοιπα δύο ένζυμα (Prot. Bac. και Prot. Gr.) ήταν εμπορικά διαθέσιμα και επιλέχθηκαν λόγω της υδρολυτικής δράσης τους ως πρωτεάσες. Τα πολυεστερικά υποστρώματα, στα οποία μελετήθηκε η δράση τους, ήταν τα βιοαποικοδομήσιμα πλαστικά πολύ(ηλεκτρικός βουτυλεστέρας) (PBS), πολυκαπρολακτόνη (PCL), πολύ(3-υδροξυ βουτυρικός) εστέρας (PHB) και πολυγαλακτικό οξύ (PLA) και τα μη βιοαποικοδομήσιμα, τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο (PET) (άμορφο και κρυσταλλικό) και πολυεστερική πολυουρεθάνη (PU). Τα συνθετικά γονίδια των πολυεστερασών (πλην των εμπορικά διαθέσιμων) εισήχθησαν σε πλασμιδιακούς φορείς (pET-22b(+), pET-26b(+)) και εκφράστηκαν ετερόλογα σε επιδεκτικά κύτταρα Escherichia coli BL21 (DE3). Η ετερόλογη έκφραση των ενζύμων βελτιστοποιήθηκε, σε όσα ήταν απαραίτητο, με την εφαρμογή διαφορετικών πρωτοκόλλων που βασίστηκαν στην μεταβολή παραγόντων όπως το θρεπτικό μέσο ανάπτυξης, η συγκέντρωση του επαγωγέα, ο χρόνος επαγωγής και άλλα. Τελικά εκφράστηκαν και απομονώθηκαν με επιτυχία τα ένζυμα Dmest, FoCut, HiC, LCC, PETase, PHOase, PUase και Se1JFR. Οι πολυεστεράσες εμφάνισαν μοριακά βάρη στο εύρος των 20-30 kDa, πλην της PUase (55 kDa). Ακολούθησε ο προσδιορισμός των βέλτιστων συνθηκών δράσης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Dmest, PHOase, PUase και Se1JFR. Η Dmest εμφάνισε βέλτιστη θερμοκρασία δράσης στους 55 °C ενώ οι PHOase, PUase και Se1JFR στους 30 °C. Αντίστοιχα η Se1JFR εμφάνισε βέλτιστη δράση σε τιμή pH 9,0 ενώ οι Dmest, PHOase και PUase σε τιμή pH 7,0. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις των ενζύμων με τα πολυεστερικά υποστρώματα, σε συνθήκες θερμοκρασίας 30 °C (FoCut, PETase, PHOase, PUase και Se1JFR) και 50 °C (Dmest, HiC, LCC, Prot. Bac., Prot. Gr.), σε ρυθμιστικό διάλυμα Νιτρικών-Φωσφορικών 0,1 M με τιμή pH 7,5, για 3 ημέρες. Η ικανότητα υποβάθμισης των πολυμερικών υλικών μελετήθηκε βάσει της προκαλούμενης, στο υλικό, μείωσης της μάζας (Δm) και των μέσων μοριακών βαρών (μέσου αριθμού μοριακού βάρους ΔMn και μέσου βάρους μοριακού βάρους ΔMw) (PBS, PCL, PHC, PLA και PU) ή της συγκέντρωσης των προϊόντων υδρόλυσης (ΣC) (άμορφο και κρυσταλλικό PET). ix Όλες οι μελετώμενες πολυεστεράσες παρουσίασαν αποτελέσματα υποβάθμισης στα περισσότερα πολυμερικά υλικά. Συγκεκριμένα όσον αφορά τα βιοαποικοδομήσιμα πλαστικά αξιοσημείωτες υποβαθμίσεις προκάλεσαν, στο σύνολό τους, τα ένζυμα Dmest, FoCut, LCC, PETase και Se1JFR. Όσον αφορά τα μη βιοαποικοδομήσιμα πλαστικά, η δράση των πολυεστερασών στην PU δεν εμφάνισε σημαντικά αποτελέσματα υδρόλυσης, πέραν των ενζύμων PETase (Δm=11,62%) και PHOase (Δm=10,43%). Στο μη βιοαποικοδομήσιμο PET, τις σημαντικότερες ενδείξεις αποικοδόμησης εμφάνισαν οι LCC (Δm=47,57%) και Dmest (Δm=46,90%), στο άμορφο και οι Dmest (Δm=4,96%, ΣC=1,658 mM) και LCC (ΣC=1,289 mM), στο κρυσταλλικό, αντίστοιχα. Έτσι η Dmest έδρασε αποτελεσματικότερα της μόνης γνωστής, έως σήμερα, θερμόφιλης PET-υδρολάσης, LCC.	el
heal.abstract	The purpose of the present diploma thesis was the discovery of novel enzymes capable of biodegrading conventional polyester plastics. In order to achieve this purpose, twelve polyesters were studied on seven different polyester substrates. Eight of the enzymes (FoCut, HiC, LCC, PETase, PHAase, PHOase, PLAase and PUase) were identified through bibliographic research and selected due to biodegradation evidence on different polyesters. Specifically, PETase and LCC are the only, to date, known hydrolases of polyethylene terephthalate. Dmest and Se1JFR were discovered using a bioinformatics tool (BLAST®), after searching different sequences which share high homology with the beforementioned PET-hydrolases. The remaining enzymes (Prot. Bac. and Prot. Gr.) were commercially available and were selected cause of their hydrolytic capability as proteases. The studied polyester substrates were biodegradable, such as polybutylene succinate (PBS), polyhydroxy butyrate (PHB), polycaprolactone (PCL) and polylactic acid (PLA) and non-biodegradable plastics such as amorphous & crystalline polyethylene terephthalate (PET) and polyester polyurethane (PU). Polyesterases’ synthetic genes were then inserted into a plasmid vector (pET-22b(+), pET-26b(+)) and heterologous expressed in competent Eschericia coli BL21 (DE3) cells. The heterologous expression of the enzymes was optimized, where necessary, through application of different protocols based on parameters such as growth medium, inducer’s concentration, induction time and more. Finally, Dmest, FoCut, HiC, LCC, PETase, PHOase, PUase and Se1JFR were successfully expressed and then purified. Polyesterases’ molecular weights were identified in the range of 20-30 kDa, except from PUase (55 kDa). Then, the optimal operating conditions of Dmest, PHOase, PUase and Se1FR, were determined. Dmest showed optimum activity at 55 °C while PHOase, PUase and Se1JFR at 30 °C. Meanwhile, Se1JFR was most active at pH 9.0 and Dmest, PHOase, PUase at pH 7.0. Subsequently, the enzymes reacted with the polyester substrates at 30 °C (FoCut, PETase, PHOase, PUase and Se1JFR) and 50 °C (Dmest, HiC, LCC, Prot. Bac., Prot. Gr.) in 0.1 M Sodium-Phosphate buffer of pH 7.5, at 1300 rpm, for 3 days long. The degradation of polymer materials was studied based on weight loss (Dm) and average molecular weights loss (number average molecular weight DMn and weight average molecular weight DMw) (for PBS, PCL, PHB, PLA and PU) or total concentration of hydrolysis products (ΣC) (for amorphous and crystalline PET). The studied polyesterases showed degradation results in most of the polymer materials. Specifically, on biodegradable plastics the most significant degradation rates were caused, in total, by Dmest, FoCut, LCC, PETase and Se1JFR. xi As far as, the non-biodegradable plastics concerns, the action of most polyesterases on PU didn’t cause significant hydrolysis results, except for PETase (Δm=11.62%) and PHOase (Δm=10.43%). The most distinct biodegradation results in PET, were caused by, LCC (Dm=47.57%) and Dmest (Dm=46.90%) in amorphous and Dmest (Dm=4.96%, ΣC=1.658 mM) and LCC (ΣC=1.289 mM) in crystalline, respectively. It’s obvious that Dmest acted more effectively on crystalline PET than the, only known to date, thermophilic PET-hydrolase, LCC.	en
heal.advisorName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Kordatos, Konstantinos	en
heal.committeeMemberName	Vouyiouka, Stamatina	en
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	184 σ.	en
heal.fullTextAvailability	false