Ανάκτηση βιοδραστικών συστατικών από μικροφύκη Chlorella pyrenoidosa, με εφαρμογή παλμικών ηλεκτρικών πεδίων

Stathi, Sofia; Στάθη, Σοφία

dc.contributor.author	Stathi, Sofia	en
dc.contributor.author	Στάθη, Σοφία	el
dc.date.accessioned	2022-05-11T06:52:38Z
dc.date.available	2022-05-11T06:52:38Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/55129
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.22827
dc.rights	Default License
dc.subject	Microalgae	en
dc.subject	Cell permeability	en
dc.subject	Bioactive compounds	en
dc.title	Ανάκτηση βιοδραστικών συστατικών από μικροφύκη Chlorella pyrenoidosa, με εφαρμογή παλμικών ηλεκτρικών πεδίων	el
heal.type	bachelorThesis
heal.secondaryTitle	Recovery of bioactive compounds from microalgae Chlorella pyrenoidosa by applying pulsed electric fields	en
heal.classification	Food Science	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2021-10-07
heal.abstract	Τα τελευταία χρόνια, η ανάγκη για λειτουργικά συστατικά τροφίμων φυσικής προέλευσης έχει σημειώσει κατακόρυφη αύξηση, με την βιομηχανία τροφίμων να αποσκοπεί στην εύρεση οικονομικά βιώσιμων λύσεων για την παραγωγή ασφαλών βιοδραστικών συστατικών. Αναγνωρισμένη πηγή πολύτιμων συστατικών με υψηλή διατροφική και βιολειτουργική αξία αποτελούν τα μικροφύκη. Πρόκειται για φωτοσυνθετικούς οργανισμούς που αναπτύσσονται σε αλμυρά ή γλυκά νερά και εμπεριέχουν σημαντικές ποσότητες πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, πρωτεϊνών και αντιοξειδωτικών. Το μικροφύκος Chlorella pyrenoidosa, του γένους των χλωροφυκών, είναι ένα ευρέως διαδεδομένο μικροφύκος στην βιομηχανία τροφίμων για την διατροφική του αξία και τις βιοδραστικές ιδιότητες των συστατικών του. Συγκεκριμένα, πρόκειται για έναν μονοκύτταρο μικροοργανισμό, με σχήμα σφαιρικό. Είναι πλούσια πηγή πρωτεϊνών, βιταμινών και χρωστικών και αντιοξειδωτικών ουσιών, με κύριες τις χλωροφύλλες και τη λουτεΐνη. Η ανάκτηση αυτών των συστατικών έχει μεγάλη σημασία για την εφαρμογή τους, εφόσον το σκληρό και ανθεκτικό κυτταρικό τοίχωμα των μικροφυκών εμποδίζει την έκφραση της βιολειτουργικής τους δράσης. Προκειμένου να εκχυλιστούν αυτά τα συστατικά, απαραίτητη είναι η διάρρηξη του κυτταρικού τοιχώματος και της μεμβράνης που τα περιβάλλει, αλλά και των μεμβρανών των οργανιδίων που μπορεί να περιέχονται. Προκειμένου να διαρρηχθούν αυτά τα εμπόδια, έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι κυτταρικής διάρρηξης οι οποίες μπορούν να διακριθούν σε θερμικές και μη θερμικές. Αυτές διαρρηγνύοντας ή και καταστρέφοντας τη δομή του τοιχώματος και των μεμβρανών των κυττάρων, καθιστούν τα κύτταρα πιο διαπερατά, αυξάνοντας την εκχυλισιμότητα. Κύριο μειονέκτημα των θερμικών μεθόδων έναντι των μη θερμικών, είναι η αλλοίωση θερμικά ευαίσθητων συστατικών και η χρήση οργανικών διαλυτών, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από υψηλή τοξικότητα και επικινδυνότητα. Μη θερμικές μέθοδοι διάρρηξης, που χαρακτηρίζονται από επιστημονικό και βιομηχανικό ενδιαφέρον είναι η ομογενοποίηση υψηλής πίεσης και τα παλμικά ηλεκτρικά πεδία. Η ομογενοποίηση υψηλής πίεσης είναι μια μηχανική, μη θερμική μέθοδος, η οποία προκαλεί τη θραύση των κυττάρων με την άσκηση υψηλών πιέσεων στο κυτταρικό αιώρημα. Η επεξεργασία με παλμικά ηλεκτρικά πεδία περιλαμβάνει την εφαρμογή ηλεκτρικών παλμών υψηλής τάσης συνεχούς ρεύματος, εντός ενός μέσου, το οποίο είναι τοποθετημένο μεταξύ δύο ηλεκτροδίων, με αποτέλεσμα τη δημιουργία πόρων στην επιφάνεια των κυττάρων. Οι διεργασίες αυτές χρησιμοποιούνται ως προκατεργασίες της ανάκτησης ενδοκυτταρικών συστατικών, ώστε να αυξήσουν την απόδοση μειώνοντας το κόστος και τον χρόνο της εκχύλισης. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, έγινε χρήση της ξηρής βιομάζας του μικροφύκους Chlorella pyrenoidosa και μελετήθηκε η διεργασία των παλμικών ηλεκτρικών πεδίων σε διαφορετικές συνθήκες ειδικής ενέργειας (76.0, 138.7 και 220.0 kJ kg που αντιστοιχούν σε 300,600 και 1000 παλμούς), για την αύξηση της διαπερατότητας των κυττάρων. Για τον προσδιορισμό της συνολικής περιεκτικότητας της βιομάζας σε χλωροφύλλες και καροτενοειδή χρησιμοποιήθηκε η διεργασία της ομογενοποίησης υψηλής πίεσης, λόγω της πλήρους καταστροφής της δομής του κυτταρικού τοιχώματος που μπορεί να επιτευχθεί (800 bar, 10 διελεύσεις). Η επεξεργασία με παλμικά ηλεκτρικά πεδία επιλέχθηκε λόγω της δημιουργίας πόρων, που επιφέρει στην κυτταρική μεμβράνη του κυττάρου του μικροφύκους Chlorella pyrenoidosa, δεδομένου ότι απελευθερώνεται το ενδοκυτταρικό περιεχόμενο, χωρίς να αλλοιώνεται η σύσταση των συστατικών των κυττάρων. Στο Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, παρασκευάστηκε αιώρημα 5 % w/w με χρήση ξηρής βιομάζας του μικροφύκους Chlorella pyrenoidosa. Σε 95 mL νερού προστέθηκαν 5 g ξηρής βιομάζας. Αυτό υπέστη επεξεργασία με παλμικά ηλεκτρικά πεδία και στη συνέχεια οδηγήθηκε προς εκχύλιση, αναδιαλύοντας την επεξεργασμένη βιομάζα σε διαλύματα αιθανόλης σε νερό περιεκτικότητας 95, 85 και 75% v/v σε αιθανόλη. Η εκχύλιση των επεξεργασμένων και ανεπεξέργαστων δειγμάτων πραγματοποιήθηκε σε υδατόλουτρο υπό συνεχή ανάδευση σε 170 rpm και σε θερμοκρασίες εκχύλισης 30, 45 και 60 °C, για χρονική διάρκεια έως και 6 h. Αρχικά, έγινε μαθηματική μοντελοποίηση της ανάκτησης των χλωροφυλλών με τη χρήση της εξίσωσης-μοντέλου : C = Ce − (Ce − C0 ) ∙ e − t τ . Έτσι, μελετήθηκε το μέγιστο ποσοστό ανακτημένων χλωροφυλλών, εκφρασμένο σε mg ανακτημένων χλωροφυλλών 100 mg ολικών χλωροφυλλών της βιομάζας. Βρέθηκε ότι, τόσο η θερμοκρασία επώασης, η περιεκτικότητα του διαλύτη σε αιθανόλη, όσο και η προεπεξεργασία με παλμικά ηλεκτρικά πεδία επηρέασαν σημαντικά το τελικό ποσοστό ανάκτησης χλωροφυλλών, με αυτό να φτάνει στην θερμοκρασία των 60°C , περιεκτικότητα σε αιθανόλη 95 % v/v και στους 1000 παλμούς ποσοστό 99.4 ± 2.6 mg ανακτημένων χλωροφυλλών 100 mg ολικών χλωροφυλλών της βιομάζας , έναντι του 23.1 ± 0.4 mg ανακτημένων χλωροφυλλών 100 mg ολικών χλωροφυλλών της βιομάζας, το οποίο ανακτήθηκε σε ανεπεξέργαστο δείγμα, η εκχύλιση του οποίου έγινε σε διαλύτη 75 % περιεκτικότητας σε αιθανόλη και σε Τ = 30°C. Έπειτα, το εκχύλισμα μελετήθηκε ως προς την συνολική αντιοξειδωτική του ικανότητα, TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), η οποία εκφράστηκε σε ισοδύναμα trolox ( mg trolox g ξηρής βιομάζας ) και μοντελοποιήθηκε με χρήση της εξίσωσης –μοντέλου: TEAC = TEACe − (TEACe − TEAC0 ) ∙ e − t τTEAC . Έτσι, εξετάστηκε η επίδραση των επιμέρους παραμέτρων της εκχύλισης στην παράμετρο TEACe , η οποία αναφέρεται στην τελική αντιοξειδωτική ικανότητα του εκχυλίσματος, μετά το πέρας των 6 ωρών επώασης. Μέγιστο εμφανίστηκε σε θερμοκρασία 60°C περιεκτικότητας 95 % σε αιθανόλη στους 1000 παλμούς και ίσο με 3.22 ± 0.04 mg ισοδύναμων trolox g ξηρής βιομάζας . Αυξανόμενης της περιεκτικότητας σε αιθανόλη του διαλύτη, αλλά και με αύξηση των εφαρμοζόμενων παλμών, η συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα αυξανόταν, επίσης, σημαντικά. Αναφορικά με τη θερμοκρασία, η επίδραση αυτής ποσοτικοποιήθηκε με την εφαρμογή της εξίσωσης Arrhenius στην παράμετρο TEACe . Η ενέργεια ενεργοποίησης, ωστόσο, δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντικές διαφορές, αν συγκριθούν τα ανεπεξέργαστα με τα επεξεργασμένα, με παλμικά ηλεκτρικά πεδία, κύτταρα. Επίσης, εξετάστηκε η επίδραση των παραμέτρων της εκχύλισης στο ποσοστό της λουτεΐνης, που ανακτήθηκε από την εκχύλιση του μικροφύκους Chlorella pyrenoidosa. Αυξανόμενης της θερμοκρασίας, της περιεκτικότητας σε αιθανόλη καθώς και με την αύξηση των παλμών που εφαρμόζονταν στην μέθοδο με παλμικά ηλεκτρικά πεδία, αυξανόταν και το ποσοστό της εκχυλισμένης λουτεΐνης, προσδίδοντας μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση στο εκχύλισμα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει και η επιλεκτικότητα της εκχύλισης ως προς τις χλωροφύλλες μεταξύ τους, αλλά και ως προς τη λουτεΐνη έναντι των χλωροφυλλών Cα και Cβ. Για να γίνει αυτό μετρήθηκαν οι λόγοι Cα Cβ και lut Cα+Cβ . Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι με τη μείωση της περιεκτικότητας σε αιθανόλη, ο λόγος Cα Cβ μειώνεται, παρατηρείται, δηλαδή, αύξηση της χλωροφύλλης β στο εκχύλισμα. Αυτό συμβαίνει, λόγω της ευδιαλυτότητας της χλωροφύλλης β στο νερό, εξαιτίας της παρουσίας φορμυλομάδας στο μόριο της. Ο λόγος, lut Cα+Cβ από την άλλη αυξάνεται με τη μείωση της περιεκτικότητας του διαλύτη σε αιθανόλη, φτάνοντας τη μέγιστη τιμή 1.07 ± 0.03 στους 1000 παλμούς PEF, σε θερμοκρασία 60°C και περιεκτικότητα 75 % σε αιθανόλη. Αξίζει να αναφερθεί πως στην θερμοκρασία των 60°C και τη χαμηλή περιεκτικότητα 75 % σε αιθανόλη κατ’ όγκο, υπάρχει ο κίνδυνος υποβάθμισης των χλωροφυλλών, λόγω της θερμότητας και της παρουσίας νερού σε ποσοστό ανώτερο του 10 % στο διαλύτη. Στην ίδια συνθήκη και για παλμούς υψηλότερους των 300, το εκχύλισμα ήταν πλούσιο σε λουτεΐνη, η οποία έχει έντονη αντιοξειδωτική δράση. Έντονη επίδραση είχε η επεξεργασία με παλμικά ηλεκτρικά πεδία στην μείωση του χρόνου t95 . Ο χρόνος t95 είναι ο χρόνος κατά τον οποίο το ποσοστό ανάκτησης των χλωροφυλλών ή των ισοδυνάμων trolox, ισούται με το 95 % του Ce ή TEACe αντίστοιχα, σχετιζόμενα με τις αντίστοιχες μεταβλητές Ce ή TEACe μίας εκχύλισης αναφοράς (δείγματα control). Τέλος, μετρήθηκαν τα ξηρά βάρη των εκχυλισμάτων, ύστερα από ξήρανση στους 100°C και παραμονή τους εκεί για 24 h. Παρατηρήθηκε ότι στο ξηρό βάρος του εκχυλίσματος επιδρά μόνο η θερμοκρασία σαν παράμετρος της εκχύλισης. Η σύσταση του διαλύτη σε αιθανόλη και η επεξεργασία με παλμικά ηλεκτρικά πεδία βρέθηκε πως δεν επηρεάζουν το ξηρό βάρος των εκχυλισμάτων. Αυτό διαπιστώθηκε ότι συμβαίνει λόγω της συμπαράσυρσης στο εκχύλισμα και άλλων συστατικών πέραν των φυσικών χρωστικών που μελετώνται. Το γεγονός αυτό μεταφράζεται στην παραλαβή πλουσιότερων εκχυλισμάτων στα συστατικά που μελετήθηκαν, χρησιμοποιώντας την τεχνολογία των παλμικών ηλεκτρικών πεδίων. Βάσει των αποτελεσμάτων της μελέτης, η μέθοδος των παλμικών ηλεκτρικών πεδίων σε αιωρήματα του μικροφύκους Chlorella pyrenoidosa, μπορεί να συνεισφέρει είτε στη μείωση της θερμοκρασίας εκχύλισης, είτε στην μείωση της περιεκτικότητας του διαλύτη εκχύλισης σε αιθανόλη. Η συνθήκη των 1000 παλμών, η εκχύλιση στους 60 °C και χρήση διαλύτη 95% σε αιθανόλη επέφεραν τη μέγιστη ανάκτηση χλωροφυλλών (~100%). Σχετικά με τα ανεπεξέργαστα κύτταρα, το μέγιστο ποσοστό ανάκτησης χλωροφυλλών (~80%) προέκυψε με χρήση διαλύτη 95 % σε αιθανόλη και θερμοκρασίας εκχύλισης 60 °C. Προκειμένου να επιτευχθεί πρακτικά ίδιο ποσοστό ανακτημένων χλωροφυλλών με το μέγιστο ποσοστό από τα ανεπεξέργαστα κύτταρα, η εφαρμογή των 600 παλμών στην επεξεργασία με παλμικά ηλεκτρικά πεδία έδωσε τη δυνατότητα είτε της μείωσης της θερμοκρασίας στους 45 °C , με διατήρηση της περιεκτικότητας της αιθανόλης σε 95 % v/v, είτε τη μείωση της περιεκτικότητας σε 85 % v/v, με διατήρηση της θερμοκρασίας στους 60 °C. Αναφορικά με τη λουτεΐνη, o βέλτιστος συνδυασμός συνθηκών για την επίτευξη του μέγιστου ποσοστού ανάκτησης αυτής (~95%) στο εκχύλισμα του μικροφύκους Chlorella pyrenoidosa, ήταν η επεξεργασία με παλμικά ηλεκτρικά πεδία με 1000 παλμούς, σε θερμοκρασία εκχύλισης 60°C και χρήση διαλύτη 95% σε αιθανόλη. Στα ανεπεξέργαστα κύτταρα, το μέγιστο ποσοστό ανάκτησης λουτεΐνης (~67%), παρατηρήθηκε στους 60°C με χρήση αιθανόλης 95%. Έτσι, με σκοπό να ανακτηθεί πρακτικά το ίδιο ποσοστό λουτεΐνης, διερευνήθηκαν τα ποσοστά ανάκτησης, όπως προέκυψαν από την εφαρμογή των παλμικών ηλεκτρικών πεδίων. Διαπιστώθηκε, ότι η επεξεργασία με 300 παλμούς, όπου το ποσοστό ανακτημένης λουτεΐνης έφτασε το 66 %, θα μπορούσε να συνδυαστεί είτε με θερμοκρασία εκχύλισης ίση με 45°C και χρήση αιθανόλης 95%, είτε με θερμοκρασία 60°C και ποσοστό αιθανόλης του διαλύτη 85%. Επίσης, η εφαρμογή 600 παλμών, με διατήρηση της θερμοκρασίας στους 60°C και μείωση της περιεκτικότητας σε 75 % αιθανόλης, οδήγησε σε πρακτικά ίδια απόδοση λουτεΐνης. Τέλος, η εφαρμογή των παλμικών ηλεκτρικών πεδίων αύξησε σημαντικά την αντιοξειδωτική ικανότητα των εκχυλισμάτων. Με την εφαρμογή 1000 παλμών, σε θερμοκρασία 60°C και χρήση αιθανόλης 95 % v/v, η αντιοξειδωτική ικανότητα αυξήθηκε κατά 18 % (από 2.72 σε 3.22 mg Trolox/g ξηρής βιομάζας). Συγκριτικά με τα παραπάνω, οι προτεινόμενες συνθήκες επεξεργασίας και εκχύλισης για την βέλτιστη ανάκτηση χλωροφυλλών ως προς τα ανεπεξέργαστα κύτταρα (600 παλμοί, 45°C, 95% αιθανόλη και 600 παλμοί, 60°C, 85% αιθανόλη) και λουτεΐνης (300 παλμοί, 45°C, 85% αιθανόλη), επέφεραν αντιοξειδωτικές ικανότητες 2.78 και 2.63 mg Trolox/g ξηρής βιομάζας, αντίστοιχα. Συμπερασματικά, η επεξεργασία της βιομάζας Chlorella pyrenoidosa με παλμικά ηλεκτρικά πεδία έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει την εκχύλιση κύριων βιοδραστικών συστατικών είτε αυξάνοντας την απόδοση της εκχύλισης, είτε μειώνοντας την περιεκτικότητα αιθανόλης και τη θερμοκρασία εκχύλισης, επιφέροντας μείωση του κόστους της διεργασίας. Η κλιμάκωση της διεργασίας σε βιομηχανική κλίμακα είναι πρακτικά υποσχόμενη καθώς ο εξοπλισμός παλμικών ηλεκτρικών πεδίων είναι διαθέσιμος και εφαρμόζεται σε τέτοια κλίμακα. Σε μια τέτοια κλιμάκωση η μείωση κόστους υλικών, η εξοικονόμηση ενέργειας και χρόνου και η φιλικότητα προς το περιβάλλον θα πρέπει να επιβεβαιωθούν ποσοτικά με τεχνοοικονομική ανάλυση και ανάλυση κύκλου ζωής και αναμένονται σημαντικά.	el
heal.sponsor	Taoukis Petros	en
heal.advisorName	Αλέξανδρος Β. Κατσιμίχας	el
heal.committeeMemberName	Oreopoulou, Vasiliki	en
heal.committeeMemberName	Zouboulakis, Eleutherios	en
heal.committeeMemberName	Taoukis Petros	en
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	176 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false