Απομόνωση και χαρακτηρισμός μιας GH10 ξυλανάσης από μετασχηματισμένο βακτηριακό στέλεχος E. coli BL21

Ντάλιος, Ανάργυρος; Ntalios, Anargyros

dc.contributor.author	Ντάλιος, Ανάργυρος	el
dc.contributor.author	Ntalios, Anargyros	en
dc.date.accessioned	2022-06-21T09:51:25Z
dc.date.available	2022-06-21T09:51:25Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/55305
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.23003
dc.rights	Default License
dc.subject	Ξυλανάσες	el
dc.subject	GH10	en
dc.subject	Γλυκοσιδικές υδρολάσες	el
dc.subject	Ένζυμα	el
dc.subject	Υδρόλυση	el
dc.title	Απομόνωση και χαρακτηρισμός μιας GH10 ξυλανάσης από μετασχηματισμένο βακτηριακό στέλεχος E. coli BL21	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2022-02-02
heal.abstract	Στη παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε μια ξυλανάση (BsXyn10) της οικογένειας 10 των γλυκοσιδικών υδρολασών (GH10) από το βακτήριο Bacillus safensis. Πραγματοποιήθηκε βιοχημικός χαρακτηρισμός της BsXyn10, ο οποίος περιελάμβανε την εύρεση του μοριακού της βάρους, των συνθηκών pH και θερμοκρασίας που επηρεάζουν τη σταθερότητα και δράση της, την εύρεση των κινητικών σταθερών, την μελέτη της επίδρασης ιόντων μετάλλων στη δράση του ενζύμου και τη διερεύνηση των προϊόντων υδρόλυσης της ξυλάνης βρώμης. Το μοριακό βάρος της BsXyn10 προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και βρέθηκε ίσο με 48 kDa. Η BsXyn10 δεν εμφανίζει δράση σε κυτταρινούχα υποστρώματα και μεταξύ των εξετασθέντων ξυλανών εμφανίζει εξειδίκευση στην υδρόλυση της αραβινοξυλάνης. Οι κινητικές παράμετροι Km και vmax υδρόλυσης της ξυλάνης βρώμης βρέθηκαν ίσες με 19.6 g/L και 8.8 mmole/mg protein/min. H τιμή του αριθμού μετατροπής kcat βρέθηκε ίση με 7038 sec-1. Οι βέλτιστες τιμές pH και θερμοκρασίας για τη δράση του ενζύμου βρέθηκαν ίσες με 7.0 και 60oC αντίστοιχα. Η ενέργεια ενεργοποίησης του ενζύμου (Εa) βρέθηκε ίση με 39.8 kJ.mol-1. Με τη βοήθεια των υπολογισθέντων τιμών του αριθμού μετατροπής kcat και της ενέργειας ενεργοποίησης Εa υπολογίσθηκαν οι μεταβολές των θερμοδυναμικών μεγεθών, ενθαλπία (ΔΗ), εντροπία (ΔS) και ελεύθερη ενέργεια Gibbs (ΔG) κατά την υδρόλυση του αμύλου, καθώς και το θερμοκρασιακό πηλίκο Q10. Το ένζυμο διατηρεί ποσοστό μεγαλύτερο του 60% της ενεργότητάς του κατά την επώασή του σε pH 5.0-8.0 στους 4oC για 24 ώρες. Η BsXyn10 εμφανίζει χρόνο ημιζωής στους 50οC ίσο με 315 min. Η ενέργεια θερμικής απενεργοποίησης (E(a)d) βρέθηκε ίση με 195.4 kJ.mol-1. Με τη βοήθεια των υπολογισθέντων τιμών της ενέργειας θερμικής απενεργοποίησης (E(a)d) και των σταθερών θερμικής απενεργοποίησης (kd) υπολογίσθηκαν οι μεταβολές των θερμοδυναμικών μεγεθών, ενθαλπία (ΔΗ), εντροπία (ΔS) και ελεύθερη ενέργεια Gibbs (ΔG) κατά τη θερμική απενεργοποίηση της BsXyn10. Η παρουσία Κ+ ενεργοποιεί την BsXyn10 ενώ τα υπόλοιπα εξετασθέντα ιόντα (Na+, Fe3+, Ca2+, Ba2+, Co2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+) δρουν ανασταλτικά στη δράση της σε διαφορετική έκταση το καθένα από αυτά. Ο επιφανειοδραστικός παράγοντας SDS ανέστειλε πλήρως τη δράση της BsXyn10, ενώ ο χηλικός παράγοντας EDTA έδρασε P a g e \| ii ανασταλτικά στη δράση της BsXyn10. Τα κύρια προϊόντα (οι ξυλοολογοσακχαρίτες) της υδρόλυσης της ξυλάνης βρώμης από την BsXyn10 ήταν η ξυλοβιόζη (Χ2), ξυλοτριόζη (Χ3) και ξυλοτετραόζη (Χ4).	el
heal.advisorName	Μαμμά, Διομή	el
heal.committeeMemberName	Mamma, Diomi	en
heal.committeeMemberName	Ευάγγελος, Τόπακας	el
heal.committeeMemberName	Παπαθανασίου, Αθανάσιος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	87 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false