Μελέτη της καταλυτικής δράσης δύο ανασυνδυασμένων λυτικών μονοοξυγενασών των πολυσακχαριτών των οικογενειών ΑΑ9 και ΑΑ16 από το θερμόφιλο μύκητα Thermothelomyces thermophilus

Γεωργάκη Κονδύλη, Νεφέλη Δήμητρα; Georgaki Kondyli, Nefeli Dimitra

dc.contributor.author	Γεωργάκη Κονδύλη, Νεφέλη Δήμητρα	el
dc.contributor.author	Georgaki Kondyli, Nefeli Dimitra	en
dc.date.accessioned	2022-06-21T10:52:33Z
dc.date.available	2022-06-21T10:52:33Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/55316
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.23014
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Thermothelomyces thermophilus	en
dc.subject	Pichia pastoris	en
dc.subject	Λιγνοκυτταρινούχος βιομάζα	el
dc.subject	Λυτικές μονοοξυγενάσες πολυσακχαριτών	el
dc.subject	Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης Ανιόντο-ανταλλαγής συζευγμένη με Αμπερομετρικό Ανιχνευτή Παλμού	el
dc.subject	Lignocellulose	en
dc.subject	Lytic Polysaccharide Monooxygenases	en
dc.subject	High-Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection	en
dc.subject	Ετερόλογη έκφραση	el
dc.subject	Βιοχημικός χαρακτηρισμός	el
dc.title	Μελέτη της καταλυτικής δράσης δύο ανασυνδυασμένων λυτικών μονοοξυγενασών των πολυσακχαριτών των οικογενειών ΑΑ9 και ΑΑ16 από το θερμόφιλο μύκητα Thermothelomyces thermophilus	el
dc.title	Biochemical characterization of two recombinant lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) of AA9 and AA16 families from the thermophilic fungus Thermothelomyces thermophilus	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.language	el
heal.language	en
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2022-02-15
heal.abstract	Οι μύκητες αποτελούν τους κύριους αποικοδομητές της λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας και η ικανότητά τους αυτή βασίζεται στα ένζυμα τα οποία κωδικοποιούν. Οι θερμόφιλοι μύκητες μπορούν να αποικοδομήσουν την λιγνοκυτταρινούχο βιομάζα ακόμα και σε υψηλότερες θερμοκρασίες. Στην παρούσα διπλωματική εργασία αξιοποιήθηκε ο θερμόφιλος μύκητας Thermothelomyces thermophilus, ο οποίος φέρει στο γονιδίωμά του, μεταξύ άλλων, δύο γονίδια που κωδικοποιούν δύο ένζυμα με δράση λυτικής μονοοξυγενάσης των πολυσακχαριτών (LPMO) των οικογενειών ΑΑ9 (MYCTH_110651) και ΑΑ16 (MYCTH_2306267). Οι λυτικές μονοοξυγενάσες των πολυσακχαριτών (LPMOs) αποτελούν μία κατηγορία καινοτόμων ενζύμων, τα οποία ανακαλύφθηκαν το 2010 και μπορούν να διασπούν γλυκοζιτικούς δεσμούς μέσω οξείδωσης, παρουσία Ο2 ή Η2Ο2 και ενός δότη ηλεκτρονίων. Διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αποικοδόμηση της λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας και έως τώρα έχουν κατηγοριοποιηθεί σε οχτώ οικογένειες βοηθητικής ενεργότητας (auxiliary activity, AA) της βάσης δεδομένων CAZy (http://www.cazy.org). Κύριο χαρακτηριστικό τους αποτελεί το ενεργό τους κέντρο, το οποίο διαθέτει ένα άτομο χαλκού αλλά και το γεγονός πως δρουν συνεργιστικά με άλλα υδρολυτικά ένζυμα διευκολύνοντας την δράση τους. Στην παρούσα εργασία έγινε ετερόλογη έκφραση και παραγωγή δύο LPMOs στο ευκαρυωτικό σύστημα έκφρασης της Pichia pastoris και ακολούθησε ο καθαρισμός τους. Στη συνέχεια, με σκοπό τον χαρακτηρισμό των δύο LPMOs πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις για την ανίχνευση οξειδωτικής δράσης σε υποστρώματα πολυσακχαριτών, μέσω ανάλυσης των προϊόντων με χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ανιόντο-ανταλλαγής συζευγμένη με αμπερομετρικό ανιχνευτή παλμού. Η μελέτη στη συνέχεια επικεντρώθηκε στην εξειδίκευση και την εκλεκτικότητα των δύο ενζύμων ως προς το υπόστρωμα ημικυτταρίνης. Για την ΑΑ9 LPMO, η οποία είναι γνωστή και χαρακτηρισμένη πρωτεΐνη με δράση C1 στην κυτταρίνη, υπήρξαν νέα ευρήματα, καθώς εκτός από την κυτταρίνη, μπορεί να δράσει και σε ημικυτταρίνη, ενώ παράλληλα παρατηρήθηκε ενίσχυση της οξείδωσης της ημικυτταρίνης παρουσία κυτταρίνης. Τα αποτελέσματα του βιοχημικού χαρακτηρισμού για την LPMO της οικογένειας AA16, η οποία έχει πρόσφατα χαρακτηριστεί ως καθαρά κυτταρινολυτική οικογένεια, ανέδειξαν για πρώτη φορά νέα οξειδωτική δράση σε ημικυτταρίνη. Επιπλέον, προσδιορίστηκε το μοριακό βάρος των δύο ενζύμων με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE). Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν βιοπληροφορικά εργαλεία και βάσεις δεδομένων για την πρόβλεψη των ιδιοτήτων, των χαρακτηριστικών μεγεθών αλλά και της τρισδιάστατης δομής των δύο πρωτεϊνών.	el
heal.abstract	The main natural decomposers of lignocellulosic biomass are the filamentous fungi because of the enzymatic system they encode. Thermophilic fungi can degrade lignocellulose even at high temperatures. Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) are newly discovered enzymes that play an important role in lignocellulose degradation as they oxidatively cleave glycosidic bonds on polysaccharides such as cellulose and hemicellulose. LPMOs’ active site contains a copper atom and the catalytic mechanism takes place in the presence of O2 or H2O2 and an electron donor. There are eight classified LPMO auxiliary families according to CAZy database (http://www.cazy.org), including AA9 and AA16 families. LPMOs act synergistically with other glycosyl-hydrolase enzymes, achieving higher hydrolytic yields of polysaccharides. In this study, two LPMOs are being studied, a C1 AA9 (MYCTH 110651) and an AA16 (MYCTH 2306267) from the thermophilic fungus Thermothelomyces thermophilus. The eukaryotic expression host system Pichia Pastoris was used for the heterologous expression, production and purification of the enzymes. High-Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection was used for the detection of the soluble products released from the oxidative cleavage of polysaccharidic substrates. This study focused on the substrate specificity of these two enzymes in different substrates, in particular those related to hemicellulose. The already characterized C1 cellulolytic AA9 LPMO was further investigated, revealing its activity on hemicellulose. Additionally, it was discovered that the presence of cellulose boosted hemicellulose oxidation. Regarding the LPMO from the recently characterized AA16 family, its ability to act on hemicellulose is demonstrated for the first time. Electrophoresis in SDS-PAGE gel was also used to determine the molecular weights of the two produced proteins. Finally, bioinformatic analysis was performed to predict the properties, characteristic parameters, and 3D structure of the two LPMOs.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.advisorName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Βουτσάς, Επαμεινώνδας	el
heal.committeeMemberName	Voutsas, Epaminondas	en
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διομή	el
heal.committeeMemberName	Mamma, Diomi	en
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	117 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false